第八章9聚焦色谱.pdf
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1、第八章第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节 第八节 第九节第九节第九节离子交换聚焦色谱第八章第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节 第八节 第九节色谱聚焦(色谱聚焦(chromatofocusing):是一种高分是一种高分辨的新型的蛋白质纯化技术。辨的新型的蛋白质纯化技术。是根据蛋白质是根据蛋白质的等电点,结合离子交换技术的大容量色谱的等电点,结合离子交换技术的大容量色谱,能分离几百毫克蛋白质样品,洗脱峰被聚焦能分离几百毫克蛋白质样品,洗脱峰被聚焦效应浓缩,分辨率高。效应浓缩,分辨率高。适用适用水溶性的两性分子水溶性的两性分子,如蛋白质、酶、多,如蛋白质、酶、
2、多肽、核酸等。肽、核酸等。2第八章第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节 第八节 第九节一、色谱聚焦的原理(一)(一)自动形成自动形成pH梯度梯度。(二)(二)蛋白质的色谱行为蛋白质的色谱行为(三)(三)聚焦效应聚焦效应3第八章第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节 第八节 第九节pH梯度溶液的形成在在聚焦层析聚焦层析中,当洗脱液流进中,当洗脱液流进多缓冲交换剂多缓冲交换剂时,由于交换剂带有缓冲能力的电荷基团,时,由于交换剂带有缓冲能力的电荷基团,故故pH梯度溶液可以自动形成梯度溶液可以自动形成。4第八章第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节 第
3、八节 第九节PBE94柱聚焦色谱的pH梯度5(1)(1)柱内每点的p柱内每点的pH值值从高到低逐渐下降从高到低逐渐下降。(2)从层析柱顶部到(2)从层析柱顶部到底部就形成了底部就形成了pH69的梯度。的梯度。(3)(3)pH梯度会逐渐向梯度会逐渐向下迁移。下迁移。(4)(4)底部流出液的底部流出液的pH由由9逐渐降至逐渐降至6。第八章第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节 第八节 第九节蛋白质的色谱行为当柱中当柱中pH低于蛋白质的低于蛋白质的PI时,蛋白质带时,蛋白质带正电荷正电荷,不与阴离,不与阴离交换剂结合交换剂结合,随洗脱液向下移动随洗脱液向下移动。当蛋白质移动至环境当蛋
4、白质移动至环境pH高于其高于其PI时,蛋白质时,蛋白质由带正电荷变由带正电荷变带负电荷带负电荷,并与,并与阴离子交换剂结合阴离子交换剂结合。由于洗脱剂的通过,蛋白质周围的环境由于洗脱剂的通过,蛋白质周围的环境pH 再次低于再次低于PI时,时,它又带它又带正电荷正电荷,并,并从交换剂解吸下来而下降从交换剂解吸下来而下降。移至移至pH大于大于PI时又重新结合,直至蛋白质从柱下流出。时又重新结合,直至蛋白质从柱下流出。不同蛋白质具有不同的等电点,在被离子交换剂结合以前,不同蛋白质具有不同的等电点,在被离子交换剂结合以前,移动距离移动距离是不同的,洗脱出来的先后次序是按等电点排列的。是不同的,洗脱出来
5、的先后次序是按等电点排列的。6第八章第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节 第八节 第九节聚焦效应当一种蛋白质在柱上随洗脱液下移至等当一种蛋白质在柱上随洗脱液下移至等电点处时,移动速度明显减慢。电点处时,移动速度明显减慢。此时加上此时加上相同相同的的第二个样品第二个样品,它将以洗,它将以洗脱液移动的速度下降,直至追到正在慢脱液移动的速度下降,直至追到正在慢移的第一个样品(移的第一个样品(聚焦聚焦)。)。如果加入的第二个样品的等电点比第一如果加入的第二个样品的等电点比第一个样品高,它可以越过第一个样品区先个样品高,它可以越过第一个样品区先被洗脱出来。被洗脱出来。7第八章第一节 第
6、二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节 第八节 第九节二、多缓冲剂二、多缓冲剂多缓冲剂是一种两性电解质缓冲剂,是多缓冲剂是一种两性电解质缓冲剂,是分子分子量大小不同的多种组分的多羧基多氨基化合量大小不同的多种组分的多羧基多氨基化合物物。Polybuffer96PBE94Polybuffer74PBE948第八章第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节 第八节 第九节三、多缓冲交换剂三、多缓冲交换剂PBE94是以是以交联琼脂糖交联琼脂糖6B(Sepharose 6B)为载体,)为载体,并在糖基上通过醚键偶合上配基制成的多缓冲交换并在糖基上通过醚键偶合上配基制成的多缓冲交换剂,
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- 第八 聚焦 色谱