Col5A2促进非小细胞肺癌细胞的增殖迁移侵袭并增强PI3K_AKT信号活性.pdf
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1、中 国 组 织 化 学 与 细 胞 化 学 杂 志CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY第 32 卷第 3 期2023 年 6 月Vol.32.No.3June.2023收稿日期2022-09-14 修回日期2023-06-05作者简介锅红芬,女(1981年),汉族,本科,主治医师*通讯作者(To whom correspondence should be addressed):Col5A2 促进非小细胞肺癌细胞的增殖迁移侵袭并增强 PI3K/AKT 信号活性锅红芬*,齐文秀,宋英,安琪(保定市第二中心医院病理科,保定 07275
2、0)摘要目的 探讨型胶原 2(collagen type V 2,Col5A2)蛋白在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表达、作用及其机制。方法 免疫组织化学检测人 NSCLC 组织中 Col5A2 表达,分析 Col5A2 表达与临床参数的关系。sh-Col5A2 转染 A549 细胞敲低 Col5A2 表达,CCK-8 法检测细胞增殖,集落形成实验检测细胞集落形成能力,Transwell 法检测细胞迁移和侵袭,测量敲低 Col5A2 的 A549 细胞在裸鼠体内生长,Western blot 和免疫组织化学染色分析 PI3K/AKT 信号活
3、性。结果 Col5A2 在 NSCLC 组织高表达,且 Col5A2 阳性表达与临床分期和淋巴结转移正相关。敲低 Col5A2 在体外抑制 A549 细胞增殖、迁移和侵袭,在体内抑制荷瘤生长,降低 p-PI3K 及 p-AKT 水平。结论 Col5A2 可能通过激活 PI3K/AKT信号同路通促进 NSCLC 进展和转移。关键词V 型胶原 2;非小细胞肺癌;增殖;迁移;侵袭;PI3K/AKT 信号通路中图分类号R365 文献标识码A DOI:10.16705/ki.1004-1850.2023.03.003Col5A2 promotes the proliferation,migration
4、and invasion of NSCLC cells and increases PI3K/AKT signaling activityGuo Hongfen*,Qi Wenxiu,Song Ying,An Qi(Department of Pathology,Baoding Second Central Hospital,Baoding 072750,China)AbstractObjective To investigate the expression,role and potential mechanism of collagen type V 2(Col5A2)protein in
5、 non-small cell lung cancer(NSCLC).Methods The expression of Col5A2 protein in human NSCLC tissues was detected by immu-nohistochemistry,and the relationship between Col5A2 protein expression and clinical parameters was analyzed.A549 cells were transfected with sh-Col5A2,cell proliferation was detec
6、ted by CCK-8 assay,colony formation ability was detected by colony formation assay,cell migration and invasion were detected by Transwell assay,the growth of A549 cells with Col5A2 knockdown was measured in tumor-bearing nude mice,and the PI3K/AKT signaling activity was analyzed by Western blot and
7、immunohistochemical staining.Results Col5A2 protein expression was increased in NSCLC tissues,and Col5A2 positive expression was positively correlated with clinical stage and lymph node metastasis.Knockdown of Col5A2 inhibited the proliferation,migration and invasion of A549 cells in vitro,and inhib
8、ited the tumor-bearing growth in vivo.Knockdown of Col5A2 could reduce the expression of p-PI3K and p-Akt.Con-clusion Col5A2 may promote the progression and metastasis of NSCLC by activating PI3K/AKT signaling.KeywordsCollagen type V 2;non-small cell lung cancer;proliferation;migration;invasion;PI3K
9、/AKT signaling pathway发生远端转移的 NSCLC 患者 5 年总体生存率低于5%4-5。造成 NSCLC 患者低生存率的最终主要原因为肿瘤的转移与恶性增殖6。因此,需继续深入研究 NSCLC 转移与恶性增殖的机制。胶原蛋白是细胞外基质的主要成分,在众多的生物过程中有重要的作用,如细胞增殖、迁移、分化和凋亡,在通常情况下,胶原蛋白通过不同的a链形成三聚体7。V 型胶原蛋白a2 链(collagen type V a2,COl5A2)在结直肠癌、胃癌和前列腺癌组织中高表达,是肿瘤进展转移与不良预后的生物标记物8-11。近来研究显示COl5A2也可作为肺腺癌预后的独肺癌的发病率
10、和死亡率均占所有类型肿瘤的首位,其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占所有类型肺癌发病率的 85%1。尽管过去十多年来 NSCLC 的治疗药物和干预手段得到很大发展,对 NSCLC 患者带来生存益处,但 NSCLC的 5 年总体生存率仅为 15.7%17.4%2-3,特别是中国组织化学与细胞化学杂志246第 32 卷立生物标志物12。但关于 COl5A2 在 NSCLC 中的作用及其机制,目前尚不完全清楚。李萍等13人通过KEGG富集分析方法得出PI3K/AKT和AMPK激酶信号通路可能是 Col5A2 发挥促迁移和侵袭的主要信号通路。前期大量研
11、究显示 PI3K/AKT 信号通路中关键蛋白 p-PI3K 和 p-AKT 在 NSCLC 组织中表达上调,且此信号激活可促进NSCLC进展与转移14-15。本实验中,我们研究 COl5A2 表达与 NSCLC 的临床病理参数的关系,并用细胞和动物模型分析敲低其表达对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及与PI3K/AKT 通路活性的关系。材料和方法1 试剂、细胞与动物胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司),DMEM 培养基(美国 Gibco 公司),兔抗 Col5A2、蛋白激酶 B(protein kinase B,PKB/AKT)、磷酸化AKT(phosphorylated AKT,pAKT)
12、、磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)和 p-PI3K单克隆抗体(南京巴傲得生物科技有限公司),兔抗GAPDH 单克隆抗体、HRP-羊抗兔 IgG、ECL 化学发光液和兔SP免疫组化试剂盒(北京索来科技有限责任公司),Col5A2 的 shRNA 质粒(sh-Col5A2)和对照载体质粒 sh-NC(美国 Santa Cruz 公司),Lipofectamine 3000(美国 Invitrogen 公司),CCK-8细胞计数试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司),Transwell 板(美国 Corning 公司),基质胶(美国BD 公司
13、),肺癌细胞 A549(中国科学院上海库),BALB/c 裸鼠(6 周龄、雄性、SPF 级,北京华阜康生物科技股份有限公司)。2 患者组织取样收集 60 例行手术切除的 NSCLC 患者的肿瘤组织和癌旁非肿瘤组织及临床特征信息。将所有组织样品用 10%福尔马林固定后,行石蜡包埋和切片。3 细胞培养与转染A549 细胞培养在加 10%血清的 DMEM 培养基中,细胞培养箱温度为 37。待细胞处理对数生长期时,收集细胞并按 1105/mL 的密度接种于 6 孔板。次日,用无血清培养基处理 6 h 后,按照转染说明书方法,用 Lipofectamine 3000 转染试剂将 sh-Col5A2 和s
14、h-NC 分别转入 A549 细胞,shRNAs 的终浓度为10 nmol/L,转染时间为 48 h,用 Western blot 鉴定转染效果。4 细胞活力的 CCK-8 分析分别将sh-Col5A2和sh-NC转染的细胞(均5000个/mL)接种于 96 孔板,继续培养14 d。按照试剂盒方法,分别加入 10 L CCK-8 试剂并孵育2 h,酶标仪(DNM-9602G 型,北京普朗新技术有限公司)检测450 nm处光密度(OD)值,并计算相对于shNC组的细胞活力。相对细胞活力=ODsh-Col5A2/ODsh-NC100%。5 集落形成实验分 别 将 sh-Col5A2 和 sh-NC
15、 转 染 的 细 胞(均500/mL)接种于 24 孔板,然后继续培养 2 周。加入 10 L 10%甲醇固定细胞2 min,0.1%结晶紫染色30 min,计数集落数量。6 迁移与侵袭能力 Transwell 分析将 Transwell 板上的膜用基底胶(60 mg/孔)包被(检测侵袭)或不包被(检测迁移)后,将 5000个细胞(100 L PBS 配置的细胞悬浮液)加入上室,下室加入 600 L 含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基作为化学引诱物,在 37 和 5 CO2下培养 24 h。用棉签擦除膜上表面的细胞,10%甲醇固定迁入至膜下表面的细胞2 min,用0.1%结晶紫染色30 m
16、in,显微镜下计数迁移和侵袭细胞。7 Western blot细胞用 RIPA 裂解液在冰上裂解 30 min,刮取裂解物并将其在 4 下用离心机以 12 000 r/m 离心20 min,收集蛋白上清液。用 BCA 法将蛋白上清液样品测定蛋白浓度后,分别取 15 g 蛋白按照常规Western blot 步骤行凝胶转印。用 5%脱脂奶封闭膜上蛋白 30 min,按1:2000 的比例孵育抗体(Col5A2、p-AKT、AKT、p-PI3K、PI3K 和 GAPDH),4 C 过夜。以TBST 洗涤后,室温孵育 HRP 标记羊抗兔 II 抗(1:2000)1 h。TBST 洗涤后利用化学发光成
17、像仪显影,并以相对光密度值对蛋白相对表达量进行评估。8 裸鼠荷瘤实验分别将 sh-Col5A2 和 sh-NC 转染的细胞接种至BALB/c 裸鼠皮下(每只小鼠按照 5106/100 L PBS注射),注射后 3 天肉眼可见瘤体(约 50 mm3)记为 Day 0,此后用游标卡尺每周测量瘤体大小(瘤体体积=长径 短径2/2)。锅红芬等.Col5A2 促进非小细胞肺癌细胞的增殖迁移侵袭并增强 PI3K/AKT 信号活性第 3 期 2479 免疫组织化学染色将临床样本组织以及裸鼠瘤体组织行石蜡包埋、切片(4 m 厚)。将切片按照常规程序脱蜡、入水、抗原修复以及 0.3%H2O2封闭内源性过氧化物酶
18、后,加第一抗体(p-AKT 和 p-PI3K;1:200 稀释)37 孵育 45 min;PBS 洗 3 次;按照 SP 试剂盒说明书,依次加生物素标记羊抗兔二抗(1:200 稀释)37 孵育 20 min,PBS 洗 3 次,HRP 标记链霉卵白素工作液 37 孵育 20 min,PBS 洗 3 次;DAB 显色后苏木素染核,并冲洗返蓝,脱水、透明和封固。10 统计学方法用 Graphpad Prism 软件对实验数据进行统计学分析。计数资料采用2检验,两组定量资料采用双侧t 检验,多组定量资料的比较采用方差分析。P0.05时,差异被认为具有统计学意义。结 果1 Col5A2 在 NSCLC
19、 组织中高表达并与 NSCLC 进展以及转移正相关免疫组织化学染色显示,癌旁非肿瘤组织中Col5A2 均阴性,NSCLC 组织中 Col5A2 阳性表达率为 81.67%(49/60),阴性表达率为 18.33%(11/60)(图 1 和表 1)。对 Col5A2 表达水平与 NSCLC 临床病理特征的相关性分析显示(表 1),Col5A2 表达与患者年龄、性别、吸烟与否、组织学分型以及组织学分级无关,但与临床分期和淋巴结转移有关,临床分期 III 期或淋巴结转移者 Col5A2 阳性比例增高。2 敲低 Col5A2 抑制 A549 细胞增殖迁移侵袭转染 sh-Col5A2 敲低 Col5A2
20、 表达后(图 2A、B),A549 细胞活性明显降低(图 2C),集落形成数明显减少(图 2D、E),迁移力(图 2F、G)和侵袭力(图 2H、J)明显降低。3 敲低 Col5A1 抑制 PI3K/AKT 信号活性Western blot检测显示,与转染sh-NC的A549细胞相比,转染 sh-Col5A2 的 A549 细胞中 p-PI3K(图3A、B)和 p-AKT(图 3C、D)水平显著降低,由此表明 Col5A2 具有增强 PI3K/AKT 信号活性。4 敲低Col5A2抑制A549细胞荷瘤生长和瘤体组织中 PI3K/AKT 信号活性分别在小鼠皮下注射转染了 sh-NC 或 sh-Co
21、-l5A2 的 A549 细胞,每周测量瘤体体积,发现敲低了 Col5A2 的 A549 细胞形成的移植瘤体积在注射后 2 周时明显小于未敲低 Col5A2 的对照 A549 细胞形成的移植瘤,第 3 周和第 4 周时差异更为明显(图 4A、B)。对瘤体组织进行免疫组织化学染色显示,对照 A549 细胞形成的移植瘤组织中 p-PI3K和 p-AKT 阳性染色范围广且染色强度高,而转染sh-Col5A2 的 A549 细胞形成的移植瘤组织中偶见 p-PI3K 和 p-AKT 阳性染色,且染色强度低,甚至部分视野未见阳性染色,提示敲低Col5A2能抑制瘤体内PI3K/AKT 信号活性。讨 论肺癌是
22、我国第一高发也是第一致死的恶性肿表 1 Col5A2 表达与 NSCLC 临床病理特征的关系Tab.1 The association between the expression of Col5A2 and clinicopathological characteristics of NSCLCCharacteristicsCol5A2 expressionP valueNegativePositiveAge(years)0.8275531555834Gender0.867Male939Female210Smoking status0.786Smoker729Non-smoker420His
23、tological type0.975Adenocarcinoma627Squamous cell carcinoma522Clinical stages0.041Stage I+II819Stage III330Lymph node metastasis0.028Yes435No714Histological grades0.974Well and moderate731Poor418中国组织化学与细胞化学杂志248第 32 卷瘤,且发病率还呈逐年增加趋势1。虽然早期肺癌可通过手术治疗达到长期生存的效果,但约2/3的患者被发现时已是晚期2-3。此时,有手术机会的晚期肺癌多采用手术+同步放化疗
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