CRISPR_Cas技术的研究展望.pdf
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1、Advances in Microbiology 微生物前沿微生物前沿,2023,12(3),110-120 Published Online September 2023 in Hans.https:/www.hanspub.org/journal/amb https:/doi.org/10.12677/amb.2023.123013 文章引用文章引用:乌仁嘎,孙瑀,尤慧琳,张琛佳,李鑫,王美婷,于景丽,吴路瑶,郭妍,希尼尼根.CRISPR/Cas 技术的研究展望J.微生物前沿,2023,12(3):110-120.DOI:10.12677/amb.2023.123013 CRISPR/Ca
2、s技术的研究展望技术的研究展望 乌仁嘎乌仁嘎1*,孙,孙 瑀瑀2,尤慧琳,尤慧琳2,张琛佳,张琛佳2,李,李 鑫鑫2,王美婷王美婷2,于景丽,于景丽2#,吴路瑶吴路瑶2,郭郭 妍妍2,希尼尼根希尼尼根3#1内蒙古农业大学继续教育学院,内蒙古 呼和浩特 2内蒙古大学生态与环境学院,内蒙古 呼和浩特 3内蒙古农业大学兽医学院,内蒙古 呼和浩特 收稿日期:2023年6月29日;录用日期:2023年9月15日;发布日期:2023年9月26日 摘摘 要要 CRISPR/Cas系统是多数细菌及古菌在环境胁迫下长期进化形成的由系统是多数细菌及古菌在环境胁迫下长期进化形成的由RNA引导降解入侵病毒或噬菌体引导
3、降解入侵病毒或噬菌体DNA的适应性免疫系统,包括的适应性免疫系统,包括Cas蛋白与单链引导蛋白与单链引导RNAs(Single guide RNAs,sgRNAs)两个核心元件。两个核心元件。近些年来,由近些年来,由CRISPR/Cas系统发展形成的新型基因编辑技术系统发展形成的新型基因编辑技术(CRISPR/Cas技术技术)广泛应用于动物、植物、广泛应用于动物、植物、微生物的基因组编辑和调控,其原理是微生物的基因组编辑和调控,其原理是Cas蛋白受蛋白受sgRNA指引将靶向指引将靶向DNA进行基因改造,进而定向引导进行基因改造,进而定向引导基因突变并通过测序技术筛选有效的基因突变。基因突变并通
4、过测序技术筛选有效的基因突变。CRISPR/Cas技术能同时对多个位点进行编辑,对靶向技术能同时对多个位点进行编辑,对靶向DNA有相当高的亲和力和特异性,具有耗时短、编辑高效等优点。本文综述了有相当高的亲和力和特异性,具有耗时短、编辑高效等优点。本文综述了CRISPR/Cas技术在临床技术在临床治疗、植物基因编辑、微生物基因改造等多个领域的应用进展,并对治疗、植物基因编辑、微生物基因改造等多个领域的应用进展,并对CRISPR/Cas技术目前存在的问题技术目前存在的问题进行了深入讨论及展望,为今后探究进行了深入讨论及展望,为今后探究CRISPR/Cas技术在生态环境领域的应用提供了科学思路与研究
5、方技术在生态环境领域的应用提供了科学思路与研究方向。向。关键词关键词 CRISPR/Cas技术技术,临床治疗,植物基因组编辑,微生物基因改造临床治疗,植物基因组编辑,微生物基因改造 Research Progress of CRISPR/Cas Technology Wurenga1*,Yu Sun2,Huilin You2,Chenjia Zhang2,Xin Li2,Meiting Wang2,Jingli Yu2#,Luyao Wu2,Yan Guo2,Xininigen3#1College of Continuing Education,Inner Mongolia Agricultu
6、ral University,Hohhot Inner Mongolia 2 School of Ecology and Environment,Inner Mongolia University,Hohhot Inner Mongolia 3 College of Veterinary Medicine,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot Inner Mongolia *第一作者。#通讯作者。乌仁嘎 等 DOI:10.12677/amb.2023.123013 111 微生物前沿 Received:Jun.29th,2023;accep
7、ted:Sep.15th,2023;published:Sep.26th,2023 Abstract The clustered regularly interspaced short palindromic repeat(CRISPR)in many bacteria and archaea evolves into adaptive immune system under environmental stress in the long term.Ac-tually,CRISPR is guided by RNA to degrade viruses or phage DNA invadi
8、ng host bacteria and archaea.The core elements of CRISPR/Cas system include Cas protein and single guide RNAs(sgRNAs).In recent years,CRISPR/Cas technology as the novel gene editing technology devel-oped by CRISPR/Cas system has been widely used in editing and regulating genomes in animals,plants an
9、d microorganisms.The principle of CRISPR/Cas technology is that Cas protein is guided by sgRNA,genetically modified to target DNA,and then guide to target gene mutation so as to screen effective gene mutation by sequencing technology.CRISPR/Cas technology can edit mul-tiple sites at the same time,wh
10、ich has high affinity and specificity for targeted DNA from ani-mals,plants and microorganisms.It has the advantages of short time and high editing efficiency.This paper reviewed the application progress of CRISPR/Cas technology in clinical treatment,plant gene edition,microbial gene modification an
11、d other fields.Meanwhile,this study discussed and prospected the present problems of CRISPR/Cas technology.This paper can help readers to understand CRISPR/Cas technology in depth.It provides scientific ideas and research directions for exploring the application of CRISPR/Cas technology in the field
12、 of ecological environment in future.Keywords CRISPR/Cas Technology,Clinical Treatment,Plant Genome Editing,Microbial Gene Modification Copyright 2023 by author(s)and Hans Publishers Inc.This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License(CC BY 4.0).http:/creativecommo
13、ns.org/licenses/by/4.0/1.概述概述 常间回文重复序列丛集(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)及其关联蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)系统作为一类新型基因组编辑技术,相对于成本较高的锌指核酸酶(Zinc Finger Nucleases,ZFNs)技术和操作周期较长、编辑效率较低的转录激活子样效应因子核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nucleases,TALENs)技术,具有经济效益高、编辑
14、简便、缩短操作时间等优点1。更为重要的是,CRISPR/Cas 系统因缺乏稳定的整合,降低了其随机插入宿主基因组引起意外突变的可能性2。相比于 ZFNs 和 TALENs 基因编辑技术,CRISPR/Cas 技术可以敲除多倍体植物中的等位基因从而产生更显著的表型效应3 4。具体而言,CRISPR/Cas 技术的优势可以归纳为三个方面。(1)精准性:CRISPR/Cas 技术使用可编辑的 RNA 序列引导 Cas 蛋白对目标基因进行切割,从而实现靶标基因的敲除。这种高度精准的靶向性使得 CRISPR/Cas 技术可以选择性地敲除特定的等位基因,且不会对其他基因造成影响。这种精准性有助于产生更明显
15、的表型变化;(2)高效性:CRISPR/Cas 技术能够在短时间内同时对多个基因进行编辑,实现基因的快速敲除和高效基因编辑,能快速观察到表型变化;(3)灵活性:CRISPR/Cas 技术可通过引入外源 DNA 片段来恢复被敲除的等位基因,即等位基因的敲除过程是可逆的,这使得 CRISPR/Cas 技术更加灵活。因此,CRISPR/Cas 系统成为当今基因编辑和纠正基Open AccessOpen Access乌仁嘎 等 DOI:10.12677/amb.2023.123013 112 微生物前沿 因突变的主流技术。CRISPR/Cas 系统的发现为人类重特大遗传疾病的基因组治疗及抗逆品种培育和
16、微生物基因组改造带来了曙光。CRISPR/Cas 技术的发展历程大致经历六个阶段5。第一阶段为 CRISPR/Cas 系统萌芽期:上个世纪 50 年代 DNA 双螺旋的提出为微生物遗传学即生物化学的发展奠定了基础。该阶段代表性人物包括莱德伯格、科恩伯格、桑格三位大师级科学家;第二阶段为 CRISPR/Cas 系统发展初期:上个世纪70 年代末桑格测序为细菌 CRISPR/Cas 系统的测序提供了技术支撑;第三阶段为 CRISPR/Cas 系统缓慢发展期:21 世纪初发现多种微生物存在特异性 CRISPR 序列及其附近的多个编码区相关 Cas;第四阶段为 CRISPR/Cas 系统转折期:200
17、5 年首次证实 CRISPR/Cas 是细菌获得性免疫系统,2008 年发现 CRISPR序列可转录加工非编码 RNA 并介导外源核酸的干扰;第五阶段为 CRISPR/Cas 系统快速发展期:2012年 CRISPR/Cas9 系统实现靶向 DNA 双链剪切从而达到基因编辑的目的;第六阶段为 CRISPR/Cas 系统的广泛应用期。详见图 1。2.CRISPR/Cas 系统机理系统机理 CRISPR/Cas 系统是多数细菌及古菌等原核生物为抵御外来的核酸长期进化形成的由 crRNA 引导的Cas 蛋白效应复合物以裂解外来入侵的核酸形成适应性免疫系统6 7。即 CRISPR 是多数古菌和细菌在环
18、境胁迫下后天获得的一套能够识别和抵御噬菌体侵染的防御系统获得性免疫系统6 7。当噬菌体攻击宿主细胞时,CRISPR 利用宿主细胞的识别功能形成干扰噬菌体的特异性蛋白,再利用宿主特异性蛋白识别对噬菌体 DNA 片段敏感的 Cas 蛋白,最终将所识别的外源 DNA 进行切割分离6。CRISPR/Cas系统包括 Cas 蛋白与单链引导 RNAs(single guide RNAs,sgRNAs)两个核心元件6。其中 Cas 蛋白元件受特异性的单链引导 RNA(gRNAs)元件指引靶向 DNA 位点;再利用作为“剪刀”的 Cas 蛋白切割分离外源靶向的核酸序列6。详见图 2。CRISPR/Cas 系统
19、主要由 CRISPR 序列和 Cas 蛋白组成。CRISPR 序列是由细菌和古菌等原核生物基因组内抵御噬菌体侵染产生的一段重复序列。Cas 蛋白是一种核酸内切酶,通过 sgRNA 指引到前间隔序列邻近基序(Protospacer-Adjacent Motifs,PAM)序列,切割特定的 DNA 双链形成间隔(spacer)序列8。详见图 3。基于 CRISPR-Cas 基因座差异、是否出现 Cas 基因签名、保守 Cas 蛋白的系统发育分析及序列相似性,将 CRISPR-Cas 系统分为 6 种类型9。I、III 型 CRISPR-Cas 系统具有一种称为 CRISPR 相关抗病毒防御复合物的
20、多重效应复合物,而 II、V、VI 型 CRISPR-Cas 系统具有单个多结构域效应 Cas 蛋白10。CRISPR/Cas 系统中常用的 Cas 蛋白主要有 Cas3、Cas10、Cas9、Cas12a、Cas12b 与 Cas13 等10。其中Cas3、Cas9、Cas12 用于编辑 DNA,Cas13 用于编辑 RNA,Cas10 既可编辑 DNA 也可编辑 RNA10。Cas 蛋白中最常用的是 Cas9 与 Cas12a,CRISPR/Cas9 系统作为最常用的 Cas 核酸酶用于识别富含 GC 的位点,通过限制 PAM 不能识别富含 AT 非编码区11。CRISPR/Cas12a(
21、又被称为 CRISPR/Cpfl)能够识别由单个 CRISPR RNA(crRNA)引导的富含 AT 的 PAM 序列12。与 CRISPR/Cas9 相比,CRISPR/Cas12a往往具有更高的特异性、可操作性,因为 Cas12a 只需一个 RNA 分子(crRNA)而 Cas9 需两个 RNA 分子(tracrRNA 和 crRNA)12。此外,Cas12a 正在成为另一个强大的基因编辑工具,在核酸检测、疾病建模、基因治疗等方面发挥着重要作用12。Cas12a 的 RNase 活性可特异性处理 crRNA 阵列13 14。因此,Cas12a 有望成为多基因编辑的最佳候选者广泛应用于各种动
22、植物及微生物领域12。Cas13 专门识别和切割单链 RNA、其裂解由真核生物和原核生物的两个核苷酸结构域介导的15。Mahas 等和 Wada 等先后发现 CRISPR/Cas13 系统切割病毒 RNA 能增强植物对 RNA 病毒的免疫力16 10。CRISPR-Cas 系统的类型及其应用特性见表 1。乌仁嘎 等 DOI:10.12677/amb.2023.123013 113 微生物前沿 Figure 1.The development history of CRISPR/Cas technology 图图 1.CRISPR/Cas 技术的发展历程7 Figure 2.CRISPR sit
23、e structure 5 图图 2.CRISPR 位点结构5 乌仁嘎 等 DOI:10.12677/amb.2023.123013 114 微生物前沿 Figure 3.Principle of CRISPR/Cas-mediated genome edition 8 图图 3.CRISPR/Cas 介导的基因组编辑原理8 Table 1.Application characteristics and types of CRISPR/Cas system 9 10 表表 1.CRISPR/Cas 系统的类型及其应用特性9 10 类别 Type 签名基因 Signature Gene 靶标 T
24、arget 向导核酸 crRNA 特征及应用 Characteristics/Application Cas3 DNA Single crRNA 人类细胞的转录控制和基因组编辑,尚未应用于植物细胞。Cas9 DNA tracrRNA:crRNA 受限于前间隔序列邻近基序(Protospacer-Adjacent Motifs,PAM)靶点的特异性、比其他 Cas 蛋白分子量大等。Cas10 DNA/RNA Single crRNA 在人类和植物细胞中诱导双向的长片段缺失和小片段插入。Cas12 DNA Single crRNA/tracrRNA:crRNA 向导核酸不同,Cas12b 需要 c
25、rRNA 和 tracrRNA;Cas12a 只需要 crRNA,不需要 tracrRNA。且酶切方式与核酸酶结构域也各不相同。I Cas13 RNA Single crRNA 可以靶向 RNA,已被用于敲除表达的靶基因,并在植物中用于干扰 RNA 病毒的活性。注:crRNA:CRISPR RNA,常间回文重复序列丛集 RNA;tracrRNA:transactivating crRNA,反转录激活常间回文重复序列丛集 RNA。适配体作为重要的靶向剂在 CRISPR/Cas 系统进行靶向识别的过程中扮演重要角色。其作用机制是通过识别结合、切割两个阶段帮助 Cas 蛋白进行靶向识别。在识别结合阶
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