灯盏花乙素调节cGAS_STING信号通路对创伤性脑损伤大鼠神经炎症的影响.pdf
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1、中国药房 2023年第34卷第17期China Pharmacy 2023 Vol.34 No.17 2107 灯盏花乙素调节cGAS/STING信号通路对创伤性脑损伤大鼠神经炎症的影响 宋宇 1,宋明明 2,魏志玄 1,王海均 3(1.南阳医学高等专科学校第一附属医院神经外科,河南 南阳473000;2.南阳医学高等专科学校第三附属医院神经外科,河南 南阳473007;3.华中科技大学协和医院神经外科,武汉430022)中图分类号 R965 文献标志码 A 文章编号 1001-0408(2023)17-2107-06DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2023.17.1
2、1摘要 目的 探讨灯盏花乙素(Scu)改善创伤性脑损伤(TBI)大鼠神经炎症的作用及机制。方法 采用改良Feeney法构建TBI大鼠模型。将成模大鼠随机分为TBI组、Scu低剂量组(40 mg/kg)、Scu高剂量组(80 mg/kg)和环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cGAS)抑制剂组(cGAS抑制剂RU.521,450 g/kg),每组24只;另取24只大鼠作为假手术组。采用改良神经功能缺损评分(mNSS)法评估大鼠神经功能;以干/湿比重法测定大鼠脑含水量;以苏木素-伊红、原位末端标记染色法观察大鼠脑组织病理学变化和细胞凋亡情况;采用酶联免疫吸附检测法测定大鼠脑组织中干扰素(IFN-)、CXC趋化
3、因子配体10(CXCL10)、肿瘤坏死因子(TNF-)、白细胞介素6(IL-6)含量;以Western blot法检测大鼠脑组织中cGAS/干扰素基因刺激蛋白(STING)信号通路相关蛋白的表达情况。结果 与假手术组比较,TBI组大鼠的mNSS,脑含水量,脑组织细胞凋亡率,IFN-、CXCL10、TNF-、IL-6含量和cGAS、STING蛋白相对表达水平均显著升高(P0.05);脑组织存在水肿、出血、神经元病理学损伤。与TBI组比较,各给药组大鼠的上述指标及病理变化均显著改善(P0.05),且Scu的作用具有剂量依赖性(P0.05),而Scu高剂量组和cGAS抑制剂组大鼠上述指标比较差异均无
4、统计学意义(P0.05)。结论 Scu可能通过抑制cGAS/STING信号通路激活来减轻TBI大鼠神经炎症,减少其脑组织损伤及细胞凋亡,促进其神经功能恢复。关键词 灯盏花乙素;创伤性脑损伤;神经炎症;环鸟苷酸-腺苷酸合成酶;干扰素基因刺激蛋白Effects of scutellarin on neuroinflammation in rats with traumatic brain injury by regulating cGAS/STING signaling pathwaySONG Yu1,SONG Mingming2,WEI Zhixuan1,WANG Haijun3(1.Dept.
5、of Neurosurgery,the First Affiliated Hospital of Nanyang Medical College,Henan Nanyang 473000,China;2.Dept.of Neurosurgery,the Third Affiliated Hospital of Nanyang Medical College,Henan Nanyang 473007,China;3.Dept.of Neurosurgery,the Union Hospital of Huazhong University of Science and Technology,Wu
6、han 430022,China)ABSTRACTOBJECTIVE To investigate the improvement effects and mechanism of scutellarin(Scu)on neuroinflammation in rats with traumatic brain injury(TBI).METHODS The modified Feeney method was applied to construct TBI rat model.The rats were randomly grouped into TBI group,Scu low-dos
7、e group(40 mg/kg),Scu high-dose group(80 mg/kg),cyclic guanylate-adenylate synthase(cGAS)inhibitor group(cGAS inhibitor RU.521,450 g/kg),with 24 rats in each group.Other 24 rats were included in the sham operation group.The modified neurological deficit score(mNSS)method was applied to assess the ne
8、urological function of rats;the brain water content of rats was measured by dry/wet specific gravity method;hematoxylin-eosin and TdT-mediated dUTP nick-end labeling staining were applied to observe the pathological changes and apoptosis of brain tissue in rats;the levels of interferon-(IFN-),CXC ch
9、emokine ligand-10(CXCL10),tumor necrosis factor-(TNF-)and interleukin-6(IL-6)in rat brain tissue were detected by enzyme-linked immunosorbent assay;Western blot method was applied to detect the expression of cGAS/interferon gene stimulating protein(STING)signal pathway-related proteins in brain tiss
10、ue of rats.RESULTS Compared with the sham operation group,the mNSS,brain water content,apoptosis rate,the contents of IFN-,CXCL10,TNF-and IL-6,and the relative expressions of cGAS and STING proteins in TBI group increased significantly(P0.05);there were edema,bleeding and pathological damage to neur
11、ons in the brain tissue.Compared with TBI group,the above indicators and pathological changes of rats in administration groups were improved significantly(P0.05),and the effect of Scu was in a dose-dependent manner(P0.05);however,there was no statistically obvious difference in the above indicators
12、between the Scu high-dose group and the cGAS inhibitor group(P0.05).CONCLUSIONS Scu may alleviate neuroinflammation,reduce brain tissue damage and apoptosis,and promote the recovery of 基金项目 河南省医学教育研究项目(No.Wjlx2020483)第一作者 主任医师,硕士。研究方向:神经外科、脑肿瘤、脑外伤、脑出血。电话:0377-62238711。E-mail: 2108 China Pharmacy 202
13、3 Vol.34 No.17中国药房 2023年第34卷第17期neural function in TBI rats by inhibiting the activation of cGAS/STING signaling pathway.KEYWORDSscutellarin;traumatic brain injury;neuroinflammation;cyclic guanylate-adenylate synthase;interferon gene stimulating protein创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)作为一种由外部机械力引起的
14、获得性脑损伤,可导致神经损伤、行为改变和认知功能下降,严重影响患者生活质量,且由于其高发病率和长期后遗症,给患者家庭和社会带来了沉重的医疗和经济负担1。尽管TBI引发的暂时性或永久性损伤的治疗策略已取得了一定进展,但目前TBI的有效治疗仍面临巨大挑战2,仍需探索其发生发展的分子机制,从而开发更有效的治疗方案。研究显示,TBI后会发生急性、强烈的炎症级联反应,其特征是小胶质细胞激活、外周免疫细胞迁移和募集、炎症介质释放等,且这些炎症介质会诱导继发性细胞死亡并阻碍神经功能恢复,故控制TBI后炎症反应被认为是一种很有前途的治疗方法34。环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic guanylate-ade
15、nylate synthase,cGAS)/干扰素基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes,STING)信号通路是先天免疫系统中重要的模式识别及效应通路之一,能够识别存在于细胞质的异常 DNA 分子,进而诱导型干扰素(interferon type,IFN-)和其他炎症因子表达5。据报道,cGAS/STING信号通路作为IFN-反应的关键诱导因素,与多种神经退行性疾病中的神经炎症密切相关,且该通路激活后还会参与TBI后神经细胞死亡和功能障碍67。灯盏花乙素(scutellarin,Scu)是一种从黄芩、灯盏花和半枝莲中提取的黄酮类化合物,具有抗炎、抗氧化和神经
16、保护等多种药理作用89。已有研究表明,Scu通过抑制丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/核因子B(nuclear factor-B,NF-B)通路抑制氧化应激和炎症反应,从而减轻脑缺血/再灌注大鼠的脑损伤10。但Scu对TBI后神经炎症的影响及其机制尚不清楚。据此,本研究构建了TBI大鼠模型,着重观察了Scu对TBI大鼠神经炎症的影响以及cGAS/STING信号通路在此过程中的变化,以期为TBI治疗方法及相关机制的阐明提供新思路。1材料1.1主要仪器本研究所用主要仪器有:SA-100型大鼠脑立体定位仪(上海玉研科学仪器有限公司)、D
17、M IL LED型荧光显微镜(德国Leica公司)、SpectraMax iD3型多功能酶标仪美谷分子仪器(上海)有限公司。1.2主要药品与试剂本研究所用的主要药品与试剂有:Scu 对照品、cGAS抑制剂RU.521(美国MedChemExpress公司,批号分别为HY-N0751、HY-114180,纯度均不低于98.56%);苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,批号20196537);原位末端标记(TdT-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒(上海弗元生物科技有限公司,批号19
18、273185);干扰素(interferon-,IFN-)、CXC趋化因子配体10(CXC chemokine ligand-10,CXCL10)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-,TNF-)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)酶联免疫吸附检测(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒(上海酶研生物科技 有 限 公 司,批 号 分 别 为 21071196、22551682、22670618、21348216);cGAS兔多克隆抗体(美国Invitrogen公司,批号PA5-121188);STING、甘
19、油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)兔单克隆抗体及辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗(英国Abcam公司,批号分别为ab227704、ab181602、ab205718)。1.3动物本研究所用动物为SPF级健康雄性SD大鼠,共124只,78周龄,体重240280 g,购自湖北省实验动物研究中心,动物生产许可证号为SCXK(鄂)2020-0018。所有大鼠均在温度2324、光照12 h/黑暗12 h、相对湿度50%60%的环境中适应性饲养1周后开展后续实验,饲养期间自由进食和饮水。本研究动物实验符合实验动物护理和使用指南 中相关要求,并通过了南阳医学高等专科学校第一附
20、属医院医学伦理委员会批准(伦理审查批号2022-6-7-2)。2方法2.1TBI动物模型构建、分组与给药造模前大鼠禁食不禁水12 h。随机抽取24只大鼠作为假手术组,其余100只均采用改良Feeney法构建TBI模型11:腹腔注射2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉大鼠,将其呈俯卧位固定于脑立体定位仪上,以75%乙醇消毒头皮后沿脑正中线左侧切开,暴露左顶骨,于冠状缝后3 mm、矢状缝左3 mm处开一直径约5 mm的骨窗,并注意保持硬脑膜完整性;20 g重锤从25 cm高度自由落下,撞击硬脑膜,致大鼠左侧顶叶大脑皮质局灶性损伤,止血后以碘伏清洗,缝合头皮。假手术组大鼠仅开骨窗,不进行撞击,其余
21、操作同造模大鼠。若大鼠出现短暂的呼吸暂停、四肢抽搐且昏迷2 h以上,则视为TBI模型构建成功12。选取造模成功的大鼠96只,采用随机数字表法分为TBI组,Scu低、高剂量组,cGAS抑制剂组,每组24只。分组完成后,Scu低、高剂量组大鼠立即分别腹腔注射40、80 mg/kg Scu以二甲基亚砜(DMSO)溶解后再以生理盐水稀释10,并鼻内滴注等量的DMSO中国药房 2023年第34卷第17期China Pharmacy 2023 Vol.34 No.17 2109 和生理盐水;cGAS 抑制剂组大鼠鼻内滴注 450 g/kg RU.521(以DMSO溶解后再以生理盐水稀释)13,并腹腔注射等
22、量DMSO和生理盐水;假手术组和TBI组大鼠均分别腹腔注射和鼻内滴注等量DMSO和生理盐水;每隔24 h给药1次,共给药4次(包括造模当天的给药)。2.2大鼠神经功能评估采用改良神经功能缺损评分(modified neurological severity scores,mNSS)法进行评估。在第2、3次和末次给药2 h后(即给药1、2、3 d),采用mNSS法评估所有大鼠的神经功能(包括运动、反射、感觉和平衡功能4个项目),0、16、712、1318分分别表示无、轻度、中度、重度神经功能障碍14。2.3大鼠脑含水量测定采用干/湿比重法测定。末次mNSS评分结束后每组随机抽取6只大鼠,麻醉后断
23、头取脑,使用电子分析天平立即称定脑组织重量(即湿重),随后放入100 烤箱中烘烤72 h,在此期间多次称重,直至恒重(即干重)。计算脑含水量:脑含水量(%)(湿重干重)/湿重100%。2.4大鼠脑组织病理学变化观察采用HE染色法进行观察。每组另随机抽取6只大鼠,麻醉后断头取脑,将左侧损伤部位脑组织使用4%多聚甲醛固定24 h后脱水、透明、石蜡包埋和常规切片(厚度4 m)。切片脱蜡至水后依次进行苏木素、伊红染色,脱水、透明、封片后使用光学显微镜观察脑组织病理学变化并拍照。2.5大鼠脑组织细胞凋亡观察采用TUNEL染色法进行观察。取“2.4”项下脑组织石蜡切片,参照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明
24、书,依次采用TUNEL反应混合液、DAPI染色,封片后使用荧光显微镜观察并拍照。TUNEL染色阳性细胞(即凋亡细胞)的核呈绿色荧光。每张切片中随机取6个视野,使用Image J图像分析软件计数凋亡细胞和总细胞(结果取平均值),并计算脑组织细胞凋亡率:脑组织细胞凋亡率(%)凋亡细胞数/总细胞数100%。2.6大鼠脑组织中炎症因子含量测定每组另随机抽取6只大鼠,麻醉后断头取脑,采用ELISA法检测大鼠脑组织中炎症因子(IFN-、CXCL10、TNF-、IL-6)含量,具体操作参照相应试剂盒说明书进行。检测仪器为酶标仪(波长450 nm)。2.7大鼠脑组织中cGAS、STING蛋白表达测定采用Wes
25、tern blot法进行检测。将每组剩余的6只大鼠麻醉后断头取脑,将左侧损伤部位脑组织使用RIPA裂解液裂解,提取组织中总蛋白,测定蛋白浓度后进行变性,然后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,接着将分离的蛋白转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,以5%脱脂奶粉室温封闭1 h;加入cGAS、STING、GAPDH(内参)一抗(稀释比例分别为1 1 000、1 400、1 10 000),4 孵育过夜;次日洗涤后加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗(稀释比例为 1 20 000),室温孵育 1.5 h;化学发光试剂(ECL)显色。扫描图像后用
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