低苯丙氨酸紫苏肽制备工艺研究.pdf
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1、浙江大学学报(农业与生命科学版)49(4):547 556,2023Journal of Zhejiang University(Agric.&Life Sci.)http:/ 太原 030051;2.中北大学晋中产业技术创新研究院,山西 晋中 030600)摘要 为丰富低苯丙氨酸特殊医学用途配方食品,本研究以紫苏籽粕(脱脂)为原料,通过单因素及响应面分析法优化双酶水解工艺,同时探究活性炭吸附游离苯丙氨酸的条件。结果表明,双酶法水解紫苏蛋白以制备低苯丙氨酸紫苏肽的最佳工艺为:选择中性复合蛋白酶(pH 7.0)和氨基肽酶(pH 8.0),分别在55 条件下依次水解紫苏籽粕5.0、5.5 h。采用
2、200目活性炭吸附水解后游离的苯丙氨酸,经高效液相色谱检测,紫苏蛋白中苯丙氨酸释放率为96.54%,苯丙氨酸去除率为97.64%,产物中苯丙氨酸质量分数为1.10 mg/g,满足 食品安全国家标准 特殊医学用途配方食品通则(GB 299222013)中对苯丙氨酸含量的要求。本研究为低苯丙氨酸特殊医学用途配方食品的制备提供了一种有效的方法,对于推广这类食品有重要的现实意义。关键词 紫苏肽;苯丙氨酸;中性复合蛋白酶;氨基肽酶;活性炭中图分类号 Q946.1 文献标志码 A引用格式 张天伟,张志军,张芷瑜,等.低苯丙氨酸紫苏肽制备工艺研究J.浙江大学学报(农业与生命科学版),2023,49(4):5
3、47-556.DOI:10.3785/j.issn.1008-9209.2023.03.061ZHANG Tianwei,ZHANG Zhijun,ZHANG Zhiyu,et al.Study on preparation technology of low-phenylalanine perilla peptideJ.Journal of Zhejiang University(Agriculture&Life Sciences),2023,49(4):547-556.Study on preparation technology of low-phenylalanine perilla
4、peptideZHANG Tianwei1,2,ZHANG Zhijun1,2*,ZHANG Zhiyu1,2,ZHANG Hongyu1,2,LI Huizhen1,2(1.School of Chemistry and Chemical Engineering,North University of China,Taiyuan 030051,Shanxi,China;2.Jinzhong Institute of Industrial Technology and Innovation,North University of China,Jinzhong 030600,Shanxi,Chi
5、na)Abstract To enrich low-phenylalanine formula food for special medical purposes,this study used perilla defatted seed meal as the raw material to optimize the double enzymatic hydrolysis process through single factor and response surface analysis,while exploring the conditions for the adsorption o
6、f free phenylalanine by activated carbon.The results showed that the optimum conditions for the preparation of low-phenylalanine peptide by double enzymatic hydrolysis of perilla protein were as follows:the neutral complex protease(pH 7.0)and aminopeptidase(pH 8.0)were used to hydrolyze perilla seed
7、 meal at 55 for 5.0 h and 5.5 h,respectively.Then,the free phenylalanine was adsorbed by 200 mesh activated carbon.Finally,the product was detected by high performance liquid chromatography,and the phenylalanine release rate in perilla protein was 96.54%,and the phenylalanine removal rate was 97.64%
8、,and the phenylalanine content in the product was 1.10 mg/g,which could meet the national standard of National Standard for Food Safety-General Rules for Formula Food for Special Medical Purposes(GB 299222013).Therefore,this study provides an effective method for the preparation of low-phenylalanine
9、 formula food for special medical purposes,which is of great practical significance to promote it.DOI:10.3785/j.issn.1008-9209.2023.03.061基金项目:山西省重点研发计划(现代农业领域)项目(2022ZDYF123)。通信作者(Corresponding author):张志军(https:/orcid.org/0000-0002-1371-725X),E-mail:第一作者(First author):张天伟(https:/orcid.org/0009-000
10、7-7988-0846),E-mail:收稿日期(Received):2023-03-06;接受日期(Accepted):2023-04-27第 49 卷浙 江 大 学 学 报(农业与生命科学版)Key words perilla peptide;phenylalanine;neutral complex protease;aminopeptidase;activated carbon苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)也称为苯丙氨酸羟化酶缺乏症,是一种由苯丙氨酸羟化酶(phenylalaninehydroxylase,PAH)基因突变引起的常染色体隐性遗传疾病1。在PKU患者
11、体内,会出现苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)代谢辅酶四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin,BH4)缺乏或苯丙氨酸羟化酶活性降低,从而导致Phe不能被正常代谢。该疾病患者在出生3个月后表现为智力、运动发育滞后,毛发黄,皮肤白,全身和尿液有特殊鼠臭味,以及出现严重的智力残疾、癫痫行为等问题2。我国主要城市新生儿筛查的PKU发病率约为1/11 0003,明显高于全球平均水平(1/15 000)2。目前,PKU仍无法治愈,现行的治疗方法主要有基因疗法、酶疗法4和饮食疗法5等。基因疗法的目标是修复或替换致病基因,以治愈疾病。但是此类疗法中还需要解决许多技术性和安全性问题,例
12、如如何精准地编辑致病基因而不影响其他基因以及如何防止不良反应等,因此该方法目前只应用于小鼠模型阶段6。酶疗法的基本原理是通过补充机体缺乏的苯丙氨酸羟化酶来降低患者血液中Phe的含量。具体包括2种方法:一是静脉注射苯丙酮酸羟化酶剂,二是口服生物合成苯丙氨酸酶制剂。然而前者的治疗效果会因患者的年龄、饮食控制和药物剂量等因素而有所不同,并且长期使用可能会产生头痛、腹泻,甚至严重过敏等副作用;口服酶制剂并非对所有PKU患者都有效,对于某些缺乏PAH基因或PAH缺失严重的患者,其治疗效果有限7。饮食疗法是目前治疗PKU的主要方法之一,其通过限制饮食中Phe的摄入来降低患者血液中Phe的水平,从而避免Ph
13、e对神经系统产生损害。该疗法不仅安全有效,而且易于实施,适用范围广,适合终身使用。此外,该疗法不需要使用药物或同时接受其他方法治疗,对健康没有负面影响,因此被广泛应用于临床实践中8。我国PKU特殊医学用途配方食品(以下简称“特医食品”)生产面临的一个主要难题是成本较高。PKU特医食品需要使用氨基酸混合物和其他特殊原料,生产成本相对较高,导致产品价格较高,不利于患者长期食用9。目前制备PKU特医食品的主要原料是动物蛋白,如乳清蛋白和酪蛋白10-12,而植物蛋白则以玉米、小麦及大米蛋白13-15为主,且种类相对单一。紫苏为药食同源植物16-17,其蛋白质中Phe含量低且不含过敏原,是制备PKU特医
14、食品的理想原料18。基于此,本研究通过生物酶分步水解紫苏蛋白,探究活性炭吸附游离Phe以制备低苯丙氨酸肽的工艺,为低苯丙氨酸特医食品的制备提供一种切实可行的方法,这对于丰富PKU患者食品来源、增强紫苏产品开发利用具有重要意义。1 材料与方法1.1 实验材料紫苏籽粕(脱脂)由中北大学晋中产业技术创新研究院提供。甲醇、乙腈为色谱纯,双缩脲试剂、乙酸钠为分析纯,均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;18种氨基酸标准品均购自北京索莱宝科技有限公司;各种生物酶均购自河北省沧州夏盛酶生物技术有限公司。1.2 仪器与设备UltiMate 3000 高 效 液 相 色 谱 仪 购 自 美 国Thermo Fi
15、sher Scientific公司;SB25-12DTD超声波清洗机购自宁波新芝生物科技股份有限公司;CTL550台式低速大容量离心机购自湖南湘立科学仪器有限公司;ZYCGF-20T超纯水制备系统购自四川卓越水处理设备有限公司;GZX-9146MBE电热鼓风干燥箱购自上海博讯实业有限公司。1.3 实验方法1.3.1 双酶水解单因素实验紫苏籽粕按0.050 g/mL的比例溶解于纯水中,在95 下加热15 min,冷却后置于恒温水浴锅中,将溶液温度和pH值调节至适宜范围,用质量分数为1.0%的内肽酶恒温水解4.0 h,再添加质量分数为1.0%的外肽酶恒温水解4.0 h。于95 下灭酶15 min,
16、冷却后在8 000 r/min下离心20 min,取上清液冻干,待测。以Phe释放率(游离Phe含量与总Phe含量之比)为响应值衡量酶解效果19。所选内肽酶为中性复合蛋白酶(酶活力为2105 U/g,最适温度为55,最适pH值为7.0),外肽酶为氨基肽酶(酶活力为5107 U/g,最适温度为60,最适pH值为8.0)。紫苏籽粕按一定比例溶解于纯水后,于95 下548第 4 期张天伟,等:低苯丙氨酸紫苏肽制备工艺研究加热15 min,冷却后置于恒温水浴锅中,将溶液温度和pH值调节至适宜范围,加入适量内肽酶恒温水解一定时间,再添加适量外肽酶恒温水解一定时间。于95 下灭酶15 min,冷却后在15
17、 000 r/min下离心10 min后得上清液,即为酶解液。以游离Phe含量为评价指标,考察紫苏籽粕(底物)添加量(0.03、0.04、0.05、0.06、0.07 g/mL)、中性复合蛋白酶水解时间(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 h)、中性复合蛋白酶添加量(质量分数分别为 1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)、氨基肽酶添加量(质量分数分别为1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%)、氨基肽酶水解时间(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 h)对酶解工艺的影响。1.3.2 响应面优化实验设计基于单因素实验结果,以底物添加量、中性复合蛋白酶添加量、氨基肽酶添加
18、量为自变量,利用Box-Behnken法设计3因素3水平实验,优化得出双酶水解的最优工艺。实验因素与水平见表1。1.3.3 游离Phe含量测定及其氨基酸组成分析采用UltiMate 3000高效液相色谱仪测定Phe含量及其氨基酸组成。色谱条件:色谱柱为Hypersil GOLD C18液相色谱柱(250 mm4.6 mm,5 m)。流动相为乙腈(A相)及pH 5.655.70的乙酸钠缓冲液(B相)。梯度洗脱程序为0 min,20%A;015 min,20%38%A;1535 min,38%48%A;3538 min,48%49%A;3842 min,49%75%A;4250 min,75%A;
19、5055 min,75%20%A;5578 min,20%A。流速为 0.28 mL/min,进样体积为 20 L,检测波长为240 nm,柱温为25 20。总Phe含量测定:取1 mL底物于水解管内,依次添加1 mL 12 mol/L HCl、6 mL 6 mol/L HCl,充氮封管,置于120 油浴锅内水解22 h。待水解完成后冷却至室温,添加4.8 mL 10 mol/L NaOH进行中和,0.45 m滤膜过滤,取1 mL滤液于离心管内,在15 000 r/min下离心10 min,收集上清液,待测21。游离Phe含量测定:取一定量上述方法制备的水解液样品,用20 g/100 g三氯乙
20、酸等体积稀释,静置1 h,0.45 m滤膜过滤,在15 000 r/min下离心10 min,取1 mL上清液于液相小瓶中,待测。1.3.4 活性炭吸附条件分析取 1.3.1 节中制备的酶解液 10 mL,预热至25,调整pH值至4.0,在5种不同孔径的活性炭粉末中静态吸附2.0 h,活性炭添加量为50 mg/g。Phe在260 nm波长处有最强紫外吸收峰,而非芳香族氨基酸在210220 nm波长处有紫外吸收峰22-23。待吸附完成后,将滤液稀释1020倍,分别测定吸附前后的D(260 nm)、D(220 nm)值,用吸附前后D(260 nm)值的变化计算 Phe 去除率,以吸附后D(220
21、nm)/D(260 nm)值衡量活性炭对Phe的选择性吸附效果24。取1.3.1节中制备的酶解液10 mL,预热至一定温度,调整pH值至适宜范围,添加适量活性炭吸附一定时间,使用0.25 m滤膜过滤后取滤液,分别测定其在260、220 nm波长处的吸光度值。以游离Phe去除率和吸附效果为评价指标,考察 pH 值(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0)、预热温度(25、30、35、40、45)、静态吸附时间(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h)以及酶解液中活性炭添加量(30、50、70、90 mg/g)对活性炭吸附效果的影响。1.3.5 低苯丙氨酸紫苏肽产率测定在活性炭吸附完成
22、后,于15 000 r/min下离心10 min以去除活性炭,取上清液冻干。采用双缩脲法25测定其中的蛋白质含量并计算最终产率,蛋白质产率计算公式如下:蛋白质产率/%=冻干粉质量/g紫苏籽粕质量/g100.(1)1.4 数据处理与分析每次实验至少设置3个平行组,结果表示为平均值标准差。响应面优化实验结果使用Design-Expert 软件进行分析。实验数据采用 Microsoft Excel 2019进行整理与初步分析,采用SPSS 21.0软件进行方差分析,采用Origin 2018作图以及进行拟表1 低苯丙氨酸紫苏肽制备工艺优化响应面法实验因素与水平Table 1 Factors and
23、levels of response surface test for optimization of preparation technology of low-phenylalanine perilla peptide因素FactorA底物添加量Substrate addition/(g/mL)B中性复合蛋白酶添加量Neutral complex protease addition/%C氨基肽酶添加量Aminopeptidase addition/%水平 Level10.032.03.000.042.54.010.053.05.0549第 49 卷浙 江 大 学 学 报(农业与生命科学版)
24、合处理。置信区间设置为95%,以P0.05表示差异有统计学意义。2 结果与分析2.1 双酶水解单因素实验分析双酶水解蛋白质是一类利用2种不同特异性酶联合作用来水解蛋白质的方法。首先,用一种特异性较高的内切酶来切断蛋白质的部分肽键,将蛋白质分解成较小的多肽或肽段。其次,用另一种具有不同特异性的外切酶作用于内切酶切割后的多肽或肽段上,将其进一步分解成更小的多肽或单个氨基酸。由图1A可知,当紫苏籽粕(底物)添加量达到0.04 g/mL时,Phe释放率达到最大值,此时酶催化效率最大;随着紫苏籽粕添加量的进一步增加,Phe释放率显著下降,这可能是由于过量的底物或代谢产物会与酶的活性位点发生竞争,从而抑制
25、了酶的催化作用。因此,紫苏籽粕的最佳添加量为0.04 g/mL。由图1B可知,Phe释放率随着中性复合蛋白酶水解时间的延长而增加,酶解反应5.0 h后,底物浓度逐渐降低,Phe释放率不再随时间延长而显著增加。因此,中性复合蛋白酶的最佳水解时间为5.0 h。由图1C可知,在酶解反应的初始阶段,随着中性复合蛋白酶添加量的增加,酶解速率也随之增加;当酶的添加量增加到2.5%时,进一步增加酶量不会对Phe释放率产生显著影响,因此中性复合蛋白酶添加量应选择2.5%。由图1D可知,随着氨基肽酶添加量的逐步增加,Phe释放率也逐渐上升;当酶添加量增加到4.0%左右时,进一步增加酶量对Phe释放率的提高效果不
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- 苯丙氨酸 紫苏 制备 工艺 研究