地衣芽孢杆菌对鲫鱼免疫功能、抗氧化能力及肠、肝组织结构的影响.pdf
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1、水产动物2023年第44卷第18期 总第687期摘 要:为了研究饲料中添加地衣芽孢杆菌对鲫鱼肝、肠组织结构、抗氧化能力及免疫功能的影响,试验选择健康鲫鱼360尾,分为空白对照组(CK组)、地衣芽孢杆菌试验组(DY组)、嗜水气单胞菌攻毒组(CKG组)和地衣芽孢杆菌治疗组(DYG组),CK组和CKG组以基础饲料投喂,DY组和DYG组将地衣芽孢杆菌添加到基础饲料中投喂,每组3个重复,每个重复30尾鲫鱼,6周投喂试验结束后,通过腹腔注射嗜水气单胞菌的方式对CKG组和DYG组鲫鱼进行攻毒试验,测定14 d内的累计死亡率。结果显示:与CK组相比,DY组显著提高鲫鱼血清中酸性磷酸酶(ACP)活性和补体3(C
2、3)、补体4(C4)、免疫球蛋白M(IgM)含量(P0.05)。DY组显著提高鲫鱼血清中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性(P0.05),并显著降低丙二醛(MDA)含量(P0.05)。攻毒后,DYG组显著抑制氧化损伤,提高免疫能力。与CK组相比,DY组肠道绒毛长度、宽度及肌层厚度显著增加(P0.05)。攻毒后,CKG组肠道出现损伤,肠绒毛发生断裂,肠上皮细胞排列紊乱,纹状缘排列不规则,肠上皮细胞出现空泡化。DYG组较CKG组的损伤较轻,纹状缘和上皮细胞排列整齐,细胞边界明显。肝脏组织学结果显示,CK组和DY组无显著差异,攻毒后,CKG组肝细胞核偏移,排列紊乱,肝细胞出现损伤,细
3、胞核溶解,出现空泡化,肝血窦充血。DYG组的肝细胞较CKG组情况有所好转,损伤减少,排列逐渐清晰,空泡化情况有所缓解。DYG组鲫鱼14 d内累积死亡率显著低于CKG组(P0.05)。饲料中添加地衣芽孢杆菌不仅能有效提高鲫鱼血清抗氧化能力,提高其免疫功能,还能提高鲫鱼肠绒毛高度及肌肉层厚度,缓解肝脏组织结构损伤。关键词:地衣芽孢杆菌;嗜水气单胞菌;鲫鱼;抗氧化能力;免疫功能doi:10.13302/ki.fi.2023.18.009中图分类号:S816.32 文献标识码:A 文章编号:1001-991X(2023)18-0058-08Effects of Bacillus licheniform
4、is on Immune Function,Antioxidant Capacity,Intestinaland Liver Tissue Structure of Crucian CarpYAO Baolan LIU Yunna LIU Jia YAN Zihao LI Yuehong*(College of Animal Science Technology,Jilin Agricultural University,Jilin Changchun 130118,China)Abstract:In order to study the effect of adding Bacillus l
5、icheniformis to the diet on the liver and intestinal tissue structure,antioxidant capacity and immune function of crucian carp,a total of 360 healthy crucian carp selected for the experiment,which were divided into blank control group(CK group),Bacillus licheniformis test group(DY group),Aeromonas h
6、ydrophila attack group(CKG group)and Bacillus licheniformis treatment group(DYG group),CK group and CKG group were fed with basic diet,the DY and DYG groups added Bacillus licheniformis to the basic feed.Each group had three replicates,each with 30 crucian carp.After the 6-week feeding test,the CKG
7、group and DYG group crucian carp were challenged by intraperitoneal injection of Aeromonas hydrophila to determine the cumulative death rate within 14 days.The results showed as follows:compared with CK group,DY group 作者简介:么宝兰,硕士,研究方向为预防兽医学。*通讯作者:李月红,教授,博士生导师。收稿日期:2023-05-22基 金 项 目:吉 林 省 科 技 发 展 计 划
8、 重 点 研 发 项 目20230202076NC;国家重点研发计划项目“盐碱水域绿洲渔业模式示范”2020YFD0900400地衣芽孢杆菌对鲫鱼免疫功能、抗氧化能力及肠、肝组织结构的影响 么宝兰 刘芸娜 刘 佳 闫子豪 李月红*(吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春 130118)58SILIAO GONGYE2023年第44卷第18期 总第687期近年来,抗生素在水产养殖中的滥用引发出一系列耐药性和环境问题,为了寻求更好的解决办法,越来越多的学者尝试将益生菌应用到水产养殖中。芽孢杆菌是益生菌中常见的菌种,其中地衣芽孢杆菌在芽孢杆菌中是最具应用前途的菌种,因其安全、耐热、能分泌多种酶和产酶
9、量高等优点而备受关注。地衣芽孢杆菌易形成孢子,比较适合于添加到饲料中,能够降解饲料中的营养物质,使其被水产动物的肠道更加充分的吸收和利用。有研究表明,地衣芽孢杆菌不仅能够增强水产动物机体免疫力,预防水产动物的疾病,还可以有效分解水体中的有害物质。最重要的是能够平衡肠道菌群,抑制致病菌的生长繁殖1。嗜水气单胞菌是一种重要的革兰氏阴性、能动的杆状细菌,是一种生活在淡水中的人畜共患病细菌,可导致水生动物、陆生动物和人类感染,广泛存在于各种水体中2。嗜水气单胞菌会产生毒性很强的外毒素,进而引发鱼类出血性败血症3。该菌对水产养殖业造成巨大经济损失,严重阻碍了水产动物的健康发展,同时也对人类的生命健康构成
10、威胁。试验以鲫鱼为对象,探讨饲料中添加地衣芽孢杆菌对鲫鱼抗氧化能力、免疫功能及肝、肠组织结构的影响,为地衣芽孢杆菌的进一步研究奠定基础,也为鲫鱼的健康养殖开辟新的思路。1 材料1.1 菌种和试验动物地衣芽孢杆菌菌种、嗜水气单胞菌菌种由吉林农业大学动物科学技术学院水产实验室于-80 保存。试验鲫鱼360尾,平均体重为(51.50.5)g,购自长春市新立城水库,基础饲料配方及营养水平见表1,购自浙江澳华饲料有限公司。1.2 主要耗材超氧化物歧化酶试剂盒、过氧化氢酶测定试剂盒、丙二醛测定试剂盒、补体C3检测试剂盒、补体C4检测试剂盒、碱性磷酸酶测定试剂盒、免疫球蛋白M测定试剂盒和酸性磷酸酶测定试剂盒
11、均购自南京建成生物工程研究所有限公司。2 方法2.1 菌种的活化与扩增将地衣芽孢杆菌菌株接种于LB液体培养基pH(7.30.1)中活化,37 培养至对数生长期,将菌液倒入10 mL EP管中,离心,离心后弃上清液,用无菌磷酸盐缓冲液洗涤3次,并重悬于无菌生理盐水中,均significantly increased the activity of acid phosphatase(ACP)and the contents of complement 3(C3),complement 4(C4)and immunoglobulin M(IgM)in serum of carp(P0.05)and
12、the activity of alkaline phosphatase(AKP)had an increasing trend but not significant.DY group significantly increased the activities of superoxide dismutase(SOD)and catalase(CAT)in serum and decreased the content of malondialdehyde(MDA)(P0.05),after challenge,DYG group significantly inhibited oxidat
13、ive damage and improved immune ability.Compared with the CK group,the length,width and muscular thickness of intestinal villus in DY group were significantly increased(P0.05).After challenge,intestinal damage occurred in CKG group,intestinal villi were broken,intestinal epithelial cells were arrange
14、d disordered,striatum was arranged irregularly,and intestinal epithelial cells were vacuolated.Compared with CKG group,DYG group had less damage,striatum and epithelial cells were arranged neatly,and cell boundaries were obvious.The histological results of liver showed that there was no significant
15、difference between the CK group and DY group.After the challenge,the liver nuclei were displaced and disordered,hepatocytes were damaged,nucleolysis occurred,vacuolation occurred,and hepatic sinus congestion occurred.Compared with CKG group,the liver cells in DYG group were better,the damage was red
16、uced,the arrangement was gradually clear,and the vacuolation was relieved.The cumulative mortality of crucian carp in DYG group was significantly lower than CKG group(P0.05).The addition of Bacillus licheniformis to the diet can not only effectively improve the antioxidant capacity of crucian carp s
17、erum,improve its immune function,but also increase the intestinal villus height and muscle layer thickness of crucian carp,and improve the damage of liver tissue structure.Key words:Bacillus licheniformis;Aeromonas hydrophila;crucian carp;antioxidant capacity;immunity59水产动物2023年第44卷第18期 总第687期匀喷洒在基础
18、日粮饲料上,使饲料中地衣芽孢杆菌的含量达到108 CFU/g,搅拌均匀后放入烘箱,37 烘干即可,现做现用。表1 基础饲料配方及营养水平(干物质基础,%)项目原料组成面粉鱼粉花生粕豆粕玉米胚芽粕麸皮玉米油氯化胆碱磷酸二氢钙维生素预混料矿物质预混料合计营养水平粗蛋白粗脂肪粗灰分含量15.010.022.026.07.015.02.00.50.51.01.0100.042.437.029.05 注:1.维生素预混料向每千克饲料提供:VA 3 600 IU、VD3 1 000 IU、VE 80 mg、VK 35 mg、VB1 5 mg、VB2 7 mg、VB6 6 mg、VB12 0.002 mg、
19、泛酸钙 20 mg、烟酸 30 mg、叶酸 1.7 mg、生物素200 mg、肌醇90 mg;2.矿物质预混料向每千克饲料提供:铁 120 mg、锌 60 mg、锰20 mg、铜5 mg、钴0.5 mg、硒0.7 mg、碘1 mg;3.营养水平为计算值。2.2 饲养管理试验鲫鱼在80 L的玻璃缸中暂养14 d,选择健康鲫鱼360尾,分为空白对照组(CK组)、地衣芽孢杆菌试验组(DY组)、嗜水气单胞菌攻毒组(CKG组)和地衣芽孢杆菌治疗组(DYG 组),每组随机分配 3 个重复,每个重复30尾鱼。CK组和CKG组以基础饲料投喂,DY组和DYG组将地衣芽孢杆菌添加到基础饲料中投喂,每日 10:00
20、10:30、16:0016:30 进行投喂,按 3%体重日粮饲喂,连续投喂 6 周,2 d 换一次水,每次换水40 L。2.3 生长指标检测试验开始时,分别测定各组鲫鱼初始体重,饲喂6周后,称重前停食24 h,空腹测定终末体重,计算各组试验鱼的相对增重率和特定生长率。相对增重率(%)=(终末体重-初始体重)/初始体重100特定生长率(%/d)=(In终末体重-In初始体重)/饲养天数1002.4 样品采集6 周投喂试验结束后,每个玻璃缸中随机选取9 尾鱼取样,使用MS-222(200 mg/L)麻醉,从尾静脉抽取血液,4 静置24 h用以制备血清。取肝、肠组织固定在固定液中用于制备组织学切片。
21、石蜡切片的制作由塞维尔生物公司完成。然后通过腹腔注射嗜水气单胞菌的方式对剩余各组鲫鱼进行攻毒试验。每尾鱼经腹腔注射0.2 mL嗜水气单胞菌,将嗜水气单胞菌悬浮在1PBS里,剂量为107 CFU/mL。攻毒24 h后,从各组随机选择9尾鱼,其余操作同上。攻毒期间观察鲫鱼的状态并及时记录死亡情况,14 d后结束感染试验并统计累积死亡率。累积死亡率(%)=累积死亡数量/初始数量1002.5 数据统计分析使用SPSS 20.0软件对试验数据进行单因素方差分析,结果以“平均值标准差”表示,采用Tukey多重比较分析组间差异显著性,若 P0.05表示组间差异显著。3 结果与分析3.1 饲料中添加地衣芽孢杆
22、菌对鲫鱼生长性能的影响从表2可知,与CK组相比,DY组可显著提高鲫鱼终末体重、相对增重率和特定生长率(P0.05)。组别CKDY初始体重(g/尾)53.500.7052.401.10终末体重(g/尾)105.431.25b132.471.36a相对增重率(%)99.561.24b147.971.24a特定生长率(%/d)1.070.14b1.790.09a表2 地衣芽孢杆菌对鲫鱼生长性能的影响注:同列数据肩标不含有相同小写字母表示差异显著(P0.05);下表同。3.2 饲料中添加地衣芽孢杆菌对鲫鱼血清免疫指标的影响由图1可知,6周饲养试验结束后,与CK组相比,DY组显著提高鲫鱼血清中ACP活性
23、和C3、C4、IgM含量(P0.05)。但是攻毒后,受地衣芽孢杆菌的保护,与CKG组比,DYG组鲫鱼血清中AKP、ACP活性及C4含量显著提高(P0.05)。3.3 饲料中添加地衣芽孢杆菌对鲫鱼血清抗氧化能力的影响60SILIAO GONGYE2023年第44卷第18期 总第687期由图2可知,6周饲养试验结束后,DY组的鲫鱼血清中的CAT、SOD活性显著高于CK组(P0.05),MDA含量显著低于对照组(P0.05)。攻毒后,与CKG组相比,DYG组的SOD活性、MDA含量相比CKG组差异显著(P0.05)。3.4 饲料中添加地衣芽孢杆菌对鲫鱼肠道组织结构的影响由图3和表3可以看出,DY组肠
24、绒毛高度、宽度及肌肉厚度均高于对照组,CK组和DY组肠绒毛细胞结构完整,细长呈指状,形态较好。攻毒后,CKG组肠道出现损伤,肠绒毛发生断裂,肠上皮细胞排列紊乱,纹状缘排列不规则,肠上皮细胞出现空泡化。DYG组较CKG组的损伤较轻,纹状缘和上皮细胞排列整齐,细胞边界明显。注:柱形图中不含有相同小写字母表示差异显著(P0.05);图2同。图1 地衣芽孢杆菌对鲫鱼血清非特异性免疫指标的影响IgM(g/L)DYCKGDYGCK0.60.40.20组别(E)C4(g/L)DYCKGDYGCK1.51.00.50组别(D)AKP(U/mL)DYCKGDYGCK1086420组别(B)ACP(U/mL)DY
25、CKGDYGCK1086420组别(A)C3(g/L)DYCKGDYGCK0.200.150.100.050组别(C)图2 地衣芽孢杆菌对鲫鱼血清抗氧化指标的影响MDA(nmol/mL)DYCKGDYGCK151050组别(A)CAT(U/mL)DYCKGDYGCK86420组别(B)SOD(U/mL)DYCKGDYGCK86420组别(C)3.5 饲料中添加地衣芽孢杆菌对鲫鱼肝脏组织结构的影响由图4可知,经显微观察后,CK组肝细胞排列紧密,边界清晰,细胞质致密,细胞核均居于细胞的中间,肝血窦清晰可见,结构完整,DY组肝细胞与CK组相差不大。CKG组肝细胞核迁移,肝血窦充血,肝细胞出现损伤,肝
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