冬凌草甲素联合免疫因子TRAF4对非小细胞肺癌细胞自噬和凋亡的影响及机制研究.pdf
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1、天 津 中 医 药 23年11月第40卷第11期Nov.23,40 11冬凌草甲素联合免疫因子TRAF4对非小细胞肺癌细胞自噬和凋亡的影响及机制研究罗帅,陈勇(上海健康医学院附属崇明中心医院,上海202150)摘要:目的探讨冬凌草甲素联合免疫因子肿瘤坏死因子受体相关因子4(TRAF4)对非小细胞肺癌细胞自噬和凋亡的影响及机制研究。方法选择不同浓度的冬凌草甲素处理A549细胞,然后采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞的活力。体外培养A549细胞,将细胞分为对照组、冬凌草甲素组、si-NC组(转染si-NC)、si-TRAF4组(转染si-TRAF4)、冬凌草甲素+pcDNA组(转染pcDNA后,选择冬
2、凌草甲素浓度为20 mol/L处理)、冬凌草甲素+TRAF4组(转染TRAF4后,选择冬凌草甲素浓度为20 mol/L处理)。采用流式细胞术检测细胞凋亡;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、微管相关蛋白1的轻链3(LC3)、/LC3、Beclin 1、自噬相关蛋白7(ATG7)和TRAF4蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测TRAF4 mRNA表达量。结果不同浓度冬凌草甲素明显抑制细胞活力。冬凌草甲素组细胞凋亡率、Bax、Beclin 1、LC3/LC3、ATG7蛋白表达明显高于对照组;TRAF4 m
3、RNA和蛋白表达、Bcl-2蛋白表达明显低于对照组。si-TRAF4组TRAF4 mRNA和蛋白表达、Bcl-2蛋白表达明显低于si-NC组;细胞凋亡率、Bax、Beclin 1、LC3/LC3和ATG7蛋白表达明显高于si-NC组。冬凌草甲素+TRAF4组TRAF4 mRNA和蛋白表达、Bcl-2蛋白表达明显高于冬凌草甲素+pcDNA组;细胞凋亡率、Bax、Beclin1、LC3/LC3和ATG7蛋白表达明显低于冬凌草甲素+pcDNA组。结论冬凌草甲素通过下调TRAF4的表达抑制非小细胞肺癌细胞的凋亡和自噬。关键词:冬凌草甲素;TRAF4;非小细胞肺癌;自噬;凋亡中图分类号:R734.2文献
4、标志码:A文章编号:1672-1519(2023)11-1484-06DOI:10.11656/j.issn.1672-1519.2023.11.21作者简介:罗帅(1988-),男,住院医师,从事呼吸科临床诊疗工作。通讯作者:陈勇,E-mail:。引用格式:罗帅,陈勇.冬凌草甲素联合免疫因子TRAF4对非小细胞肺癌细胞自噬和凋亡的影响及机制研究J.天津中医药,2023,40(11):1484-1489.根据病理表现可以将肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌,其中非小细胞肺癌占肺癌全部的80%85%1。虽然医学上已经取得了进步,但是非小细胞肺癌的复发转移仍是当前其治疗的难点2-3。冬凌草又称为冰凌
5、草,性微寒,甘微苦,常用于治疗咽喉肿痛、蛇虫咬伤和扁桃体炎等疾病4,具有多种化学活性,如冬凌草甲素具有明显的抗肿瘤效果5。有研究结果显示,冬凌草甲素抑制肺癌细胞A549的增殖6,促进肺癌细胞的自噬小体的产生,并诱导细胞凋亡7。肿瘤坏死因子受体相关因子4(TRAF4)位于染色体17q11-12上,与肿瘤坏死受体家族信号转导密切相关8。有研究发现,miR-370通过靶向负调控TRAF4抑制肺癌细胞的增殖和促进细胞的凋亡9。但是关于冬凌草甲素是否能够联合TRAF4影响非小细胞肺癌的研究尚不明确,因此,本研究通过体外培养A549细胞,探讨冬凌草甲素联合TRAF4对细胞自噬和凋亡的影响。1材料与方法1.
6、1细胞和主要试剂A549细胞购自美国ATCC公司;冬凌草甲素购于成都普菲德公司;DMEM培养基和胎牛血清购于Hyclone公司;噻唑蓝(MTT)试剂盒购于北京索莱宝公司;Lipofectamine 2000试剂 盒 购 于 赛 默 飞 世 尔 公 司;si-NC、si-TRAF4、pcDNA、TRAF4购于广州锐博生物公司;凋亡试剂盒购于江苏凯基生物公司;B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)抗体、Bcl-2抗体、微管相关蛋白1的轻链3(LC3)抗体、LC3抗体、Beclin 1抗体、ATG7抗体、TRAF4抗体、GAPDH抗体购于美国Abcam公司;荧光定量试剂盒、逆转录试剂盒、T
7、rizol试剂购于Promega公司;引物购于上海吉玛公司。1484天 津 中 医 药 23年11月第40卷第11期Nov.23,40 11表 1不同浓度冬凌草甲素对 A549 细胞活力的影响(xs)Tab.1Effects of different concentrations of oridonin onA549 cell viability(xs)冬凌草甲素浓度细胞活力0 mol/L99.28.71 mol/L91.28.2*5 mol/L83.27.9*10 mol/L68.47.2*20 mol/L46.55.3*50 mol/L32.43.8*F124.516P0.000注:与0
8、mol/L组比较,*P0.051.2细胞培养在37、5%CO2培养箱中,A549细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基。细胞汇合率为80%时,采用胰蛋白酶进行消化传代。1.3噻唑蓝(MTT)检测细胞活力取对数生长期A549细胞并接种在96孔板中。过夜培养后,细胞与0、1、5、10、20、50 mol/L的冬凌草甲素孵育48 h。随后,细胞与MTT试剂孵育4 h,然后用二甲基亚砜(DMSO)试剂溶解结晶。利用酶标仪检测吸光度值,评估细胞活力。1.4细胞分组A549细胞接种6孔板内(1105个/mL),细胞贴壁生长后加入0、20 mol/L的冬凌草甲素,记为对照组、冬凌草甲素组。按照Lipo
9、fectamine2000说明书进行细胞转染。A549细胞转染si-TRAF4和si-NC,记为si-TRAF4组、si-NC组;将pcDNA和TRAF4转染至A549细胞后,采用20 mol/L的冬凌草甲素处理,记为冬凌草甲素+pcDNA组、冬凌草甲素+TRAF4组。1.5流式细胞术检测细胞凋亡取1.4各组A549细胞,取1 mL细胞液添加至500 L结合缓冲液内,用于制备细胞悬液。细胞与Annexin V-FITC和PI试剂孵育,利用流式细胞仪分析细胞凋亡率。1.6蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测蛋白表达取1.4中各组A549细胞4 裂解30 min,然后经过12 000 r
10、/min(离心半径为15 cm)离心10 min,收集细胞上清液,根据BCA法定量蛋白浓度,在95 变性7 min。取蛋白样品经过凝胶电泳处理,转膜,转膜结束后封闭培养1.5 h,洗膜3次,加入Bax、Bcl-2、LC3、LC3、Beclin 1、ATG7和TRAF4抗体于4 过夜培养,洗膜3次,加入二抗,室温培养1.5 h,滴加提前配置的显影液,显色、曝光。用ImageJ软件分析蛋白条带。1.7实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测mRNA表达利用Trizol试剂提取总RNA,分光光度计检测RNA样品的浓度和纯度。逆转录法合成cDNA,然后根据荧光定量试剂盒说明书进行PCR扩增反应。
11、以GAPDH为内参,分析采用2-Ct公式计算TRAF4 mRNA表达量。TRAF4上游引物为:5-CATCCACAGTGAGGAGGGCT-3,下游引物为:5-TTCATGGGGCAGCGATTAG-3;GAPDH上 游 引物为:5-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3,下游引物为:5-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3。1.8统计学方法采用SPSS 21.0软件分析实验数据。计量资料以均数标准差(xs)表示,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析。P0.05表示差异具有统计学意义。2结果2.1不同浓度冬凌草甲素对A549细胞活力的影响评估浓度为0、1、
12、5、10、20、50 mol/L的冬凌草甲素对A549细胞活力的影响。结果显示,A549细胞活力随着冬凌草甲素浓度的上升而逐渐下降(P0.05)。A549细胞半数抑制率(IC50)为22.4 mol/L,因此本研究选择20 mol/L进行后续实验。见表1。2.2冬凌草甲素对A549细胞凋亡的影响与对照组相比,冬凌草甲素组的细胞凋亡率、Bax水平显著升高(P0.05),Bcl-2水平显著下降(P0.05)。见图1、表2。2.3冬凌草甲素对A549细胞自噬的影响与对照组相比,冬凌草甲素组的Beclin 1、LC3/LC3和ATG7蛋白表达显著增加(P0.05)。见图2、表3。2.4冬凌草甲素对A5
13、49细胞中TRAF4表达的影响qRT-PCR和Western Blot检测结果显示,与对照组相比,冬凌草甲素组的TRAF4 mRNA和蛋白表达显著降低(P0.05)。见图3、表4。2.5干扰TRAF4对A549细胞凋亡和自噬的影响与si-NC组相比,si-TRAF4组的TRAF4 mRNA和蛋白表达显著降低(P0.05),细胞凋亡率、Bax、Beclin 1、LC3/LC3和ATG7水平显著上升(P0.05),Bcl-2水平显示下降(P0.05)。见图4、表5。2.6冬凌草甲素联合免疫因子TRAF4对A549细胞凋亡和自噬的影响与冬凌草甲素+pcDNA组相比,冬凌草甲素+TRAF4组的TRAF
14、4 mRNA和蛋白表达显著增加(P0.05),细胞凋亡率、Bax、Beclin 1、LC3/LC3和ATG7水平显著下降(P0.05),Bcl-1485天 津 中 医 药 23年11月第40卷第11期Nov.23,40 11图 1冬凌草甲素对 A549 细胞凋亡的影响Fig.1Effect of oridonin on apoptosis of A549 cells表 2冬凌草甲素对 A549 细胞凋亡的影响(xs)Tab.2Effect of oridonin on the apoptosis of A549 cells(xs)组别细胞凋亡率(%)BaxBcl-2对照组7.50.90.230
15、.020.850.06冬凌草甲素组23.41.9*0.770.07*0.350.04*t22.68922.25220.801P0.0000.0000.000注:与对照组比较,*P0.05。表 3冬凌草甲素对 A549 细胞自噬的影响(xs)Tab.3Effect of oridonin on autophagy in A549 cells(xs)组别Beclin 1LC3/LC3ATG7对照组0.270.030.320.040.220.02冬凌草甲素组0.680.06*1.250.11*0.640.05*t18.33623.83723.398P0.0000.0000.000注:与对照组比较,*
16、P0.05。表 4冬凌草甲素对 TRAF4 水平的影响(xs)Tab.4Effect of oridonin on TRAF4 levels(xs)组别TRAF4 mRNATRAF4蛋白对照组0.950.070.710.07冬凌草甲素组0.410.04*0.330.03*t20.09414.969P0.0000.000注:与对照组比较,*P0.05。2水平显示上升(P0.05)。见图5、表6。3讨论冬凌草甲素是从冬凌草二萜类化合物内提取分离而来的,具有明显的抗肿瘤作用,如抑制细胞增殖和转移、促进细胞凋亡等10。吴楠等11研究结果显示,冬凌草甲素通过抑制TPX2促进前列腺癌细胞的凋亡,阻滞细胞周
17、期,抑制细胞的增殖。研究发现,冬凌草甲素在宫颈癌研究中可以抑制宫颈癌细胞的增殖,促进线粒体凋亡12。黄陈翼等13在研究骨髓瘤中发现,冬凌草甲素通过抑制磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路促进骨髓瘤细胞的凋亡和抑制细胞增殖。本研究采用不同浓度(0、1、5、10、20、50 mol/L)冬凌草甲素作用A549细胞,MTT实验检测细胞的活力,结果显示,冬凌草甲素呈剂量效应降低,因此本研究采用20 mol/L(接近IC50浓度)进行后续实验,检测冬凌草甲素作用A549细胞后的机制研究。凋亡在癌症的发展中具有重要的作用,Bax和Bcl-2是Bcl-2家族的成员,Bax在细胞发生凋亡时起
18、到促进作用,其过度表达可与Bcl-2拮抗促使细胞发生凋亡14。自噬在细胞代谢和生长发育中至关重要,是一个进化保守的饥饿应答过程,Beclin 1是一种转运蛋白,可将LC3自噬蛋白转移至自噬体膜内间接促进细胞的自噬15-16。LC3是自噬标志的相关蛋白,主要两种亚型LC3、LC3,LC3没有活图 2冬凌草甲素对 A549 细胞自噬的影响Fig.2Effect of oridonin on autophagy in A549 cells图 3冬凌草甲素对 TRAF4 蛋白水平的影响Fig.3Effect of oridonin on TRAF4 protein level1486天 津 中 医 药
19、 23年11月第40卷第11期Nov.23,40 11图 4干扰 TRAF4 对 A549 细胞凋亡和自噬的影响Fig.4Effect of interference TRAF4 on apoptosis and autophagy in A549 cells表 6冬凌草甲素联合免疫因子 TRAF4 对 A549 细胞凋亡和自噬的影响(xs)Tab.6Effects of oridonin combined with immunizing factor TRAF4 on apoptosis and autophagy in A549 cells(xs)组别TRAF4 mRNATRAF4蛋白细胞
20、凋亡率(%)BaxBcl-2Beclin 1LC3/LC3ATG7冬凌草甲素+pcDNA0.360.030.290.0222.72.10.820.070.330.030.720.061.290.130.680.06冬凌草甲素+TRAF40.680.07*0.520.04*14.31.2*0.470.05*0.660.05*0.470.04*0.850.07*0.400.04*t12.60515.42910.41912.20616.97810.4018.94011.649P0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000注:与冬凌草甲素+pcDNA组比较,*P0.
21、05。表 5干扰 TRAF4 对 A549 细胞凋亡和自噬的影响(xs)Tab.5Effects of interfering with TRAF4 on apoptosis and autophagy in A549 cells(xs)组别TRAF4 mRNATRAF4蛋白细胞凋亡率(%)BaxBcl-2Beclin 1LC3/LC3IATG7si-NC0.920.070.770.057.30.70.320.040.630.060.300.020.440.050.360.03si-TRAF40.370.04*0.350.03*22.42.1*0.590.06*0.340.03*0.610.0
22、5*1.320.13*0.650.06*t20.46621.60920.46411.23312.96917.27018.95412.969P0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000注:与si-NC组比较,*P0.05。性,LC3可与线粒体受体蛋白结合促进细胞的自噬;LC3与LC3比值可以反映自噬体情况17-18。此外,LC3-I被Atg7活化,然后在膜内与磷脂酰乙醇胺(PE)偶联生成被加工的LC3-。本研究结果图 5冬凌草甲素联合免疫因子 TRAF4 对 A549 细胞凋亡和自噬的影响Fig.5Effect of oridonin combined wi
23、th immunizing factor TRAF4 on apoptosis and autophagy in A549 cells1487天 津 中 医 药 23年11月第40卷第11期Nov.23,40 11显示,冬凌草甲素能促进细胞的凋亡率,上调Bax、LC3/LC3、Beclin 1、ATG7蛋白表达,下调Bcl-2蛋白表达,提示冬凌草甲素可以诱导A549细胞的凋亡和自噬。TRAF4在多种细胞高表达,是一种致癌基因,最早在乳腺癌内发现,可以广泛参与癌细胞的发展,通过抑制TRAF4抑制肿瘤细胞增殖,促进细胞凋亡等19-20。陈刚等21研究结果显示,TRAF4在非小细胞肺癌细胞内表达上调
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