低分子量柘果多糖的制备及其抗氧化活性研究.pdf
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1、丁子康,李新月,赵猛,等.低分子量柘果多糖的制备及其抗氧化活性研究 J.食品工业科技,2023,44(19):3946.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022110253DING Zikang,LI Xinyue,ZHAO Meng,et al.Study on the Preparation and Antioxidant Activity of Low Molecular WeightPolysaccharide from Cudrania tricuspidata FruitsJ.Science and Technology of Food Industry,
2、2023,44(19):3946.(in Chinese withEnglish abstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022110253 研究与探讨 低分子量柘果多糖的制备及其低分子量柘果多糖的制备及其抗氧化活性研究抗氧化活性研究丁子康1,李新月2,赵猛2,王晓梅2,陈勇3,张忠山2,*(1.浙江农林大学食品与健康学院,浙江杭州 311300;2.湖州师范学院生命科学学院,浙江湖州 313000;3.湖州柘树农业发展有限公司,浙江湖州 313100)摘要:目的:制备低分子量的柘果多糖,并探究其对抗氧化活性的影响。方法:以柘木果实为原材料,采用H2O2
3、/VC降解法制备低分子量柘果多糖。利用高效凝胶渗透色谱和离子色谱等手段对降解前后的多糖进行理化性质分析,并比较其总抗氧化活性、还原能力、DPPH 自由基清除率和 OH 自由基清除率。结果:H2O2/VC法降解柘果多糖的较适比例为 H2O2:VC=1.5:1,增加二者浓度时分别得到 5 种低分子量柘果多糖 ZGB、ZGC、ZGD、ZGE 和 ZGF(其数均分子量分别为 49.9、30.5、27.6、25.9、28.9 kDa);红外光谱说明降解前后其结构并未发生明显改变;离子色谱表明它们均由葡萄糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸及微量的盐酸氨基葡萄糖和甘露糖组成;5 种多糖均具有抗氧
4、化活性,与其浓度呈正比,其中 ZGD(H2O2:VC=30:20 mmol/L)的抗氧化活性最佳,与粗多糖相比其总抗氧化活性和还原能力分别提高了为 42.7%和 10.8%,对OH 的清除率提高了56.3%,对 DPPH的清除率无显著增强,清除率为 87.44%。结论:降解后多糖 ZGD 的抗氧化活性最佳。关键词:柘木果实,H2O2/VC降解,低分子量多糖,抗氧化活性本文网刊:中图分类号:TS201.4 文献标识码:A 文章编号:10020306(2023)19003908DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022110253StudyonthePreparationa
5、ndAntioxidantActivityofLowMolecularWeightPolysaccharidefromCudraniatricuspidataFruitsDINGZikang1,LIXinyue2,ZHAOMeng2,WANGXiaomei2,CHENYong3,ZHANGZhongshan2,*(1.College of Food and Health,Zhejiang A&F University,Hangzhou 311300,China;2.College of Life Sciences,Huzhou University,Huzhou 313000,China;3.
6、Huzhou Zheshu Agricultural Development Co.,Ltd.,Huzhou 313100,China)Abstract:Objective:The molecular weight Cudrania tricuspidata Fruits polysaccharide was prepared and the effect ofdifferent molecular weight on their antioxidant activity was further explored.Methods:The low molecular weight cudgepo
7、lysaccharide was prepared by H2O2/VC degradation method using cudge fruit as raw material.The polysaccharides beforeand after degradation were analyzed for their physicochemical properties using high performance gel permeationchromatography and ion chromatography,and compared for their total antioxi
8、dant activity,reducing ability,DPPH radicalscavenging rate and OH radical scavenging rate.Results:The suitable ratio of this cudge polysaccharide degradation byH2O2/VC method was H2O2:VC=1.5:1,and the five kinds of cudge polysaccharide ZGB,ZGC,ZGD,ZGE and ZGF(Mn49.9,30.5,27.6,25.9,and 28.9 kDa)were
9、obtained.The structure did not change significantly after degradation by infrared 收稿日期:20221124 基金项目:浙江省基础公益研究计划项目(LGN21D060001)。作者简介:丁子康(1997),男,硕士研究生,研究方向:中药药效物质与健康产品研发,E-mail:。*通信作者:张忠山(1982),男,博士,教授,研究方向:中药药效物质与健康产品研发,E-mail:。第 44 卷 第 19 期食品工业科技Vol.44 No.192023 年 10 月Science and Technology of Fo
10、od IndustryOct.2023 spectrogram analysis.IC analysis showed that it was composed of rhamnose,arabinose,galactose,glucose,xylosegalacturonic acid and a small amount of glucosamine hydrochloride and mannose.All the five kinds of polysaccharideswith low molecular weight had antioxidant activity,which w
11、as positively correlated with its concentration.Among them,ZGD(H2O2:VC=30:20 mmol/L)had the best antioxidant activity,compared with crude polysaccharide,its total antioxidantactivity and reducing capacity increased by 42.7%and 10.8%,respectively,and the scavenging rate of OH increased by56.3%,while
12、the scavenging rate of DPPH was not significantly enhanced,and the scavenging rate was 87.44%.Conclusion:After degradation,the antioxidant activity of polysaccharide ZGD is the best.Keywords:Cudrania tricuspidata fruits;H2O2/VC degradation;low molecular weight polysaccharide;antioxidant activity 柘果为
13、桑科植物柘树(Cudrania tricuspidata(Carr.)Bur.)的果实,最早记载于浙江民间常用草药,具有“清热凉血,舒筋活络”的疗效1。其含有丰富的多糖、矿物质(钙、铁、磷、钾等)及多种维生素等成分,其中多糖是其主要的活性成分之一2。近年来,多糖已经被报道的生物活性有抗炎镇痛、保肝护肝、抗氧化、抗肿瘤、降低血压、血脂和血糖、调节免疫等3,但其生物活性受分子量、分支结构及空间结构影响很大34。多糖一级结构中的糖单元的组成以及相邻糖苷键的连接方式决定多糖的活性,高级结构中支链的类型、聚合度及其在主链上的分布情况等决定了多糖活性的强弱4。对于多糖的抗氧化活性,是因为多糖结构具有半缩醛
14、羟基,即还原末端,使得自由基还原,从而清除自由基。也有报道表明,多糖的抗氧化活性可以通过水解而增强5。未降解的多糖分子量大、分子体积大、水溶性差,不利于生物吸收发挥活性,生物利用度较差,而多糖水解为低分子量的多糖或寡糖,会使其分子结构的活性部位暴露,从而提高多糖水解产物的活性6。柘果多糖的分子量较大,在一定程度上影响了其生物学活性。为了获得较低分子量的柘果多糖,需对柘果多糖进行降解。降解多糖的方法主要有生物法对多糖链中糖苷键的断裂具有极高的特异性,成本较高,条件复杂;酸碱法降解可能导致糖单元结构的改变,破坏必要的生物活性基团;物理法对实验仪器要求较高,生产成本较高7。目前 H2O2/VC降解法
15、已经被用于多糖的降解 H2O2/VC氧化降解是一种可控性强、环境友好的获得低分子量多糖的方法。因为羟基自由基虽然是 O2的还原产物,但却是非常强的氧化剂。H2O2分解产生的羟自由基氧化断裂多糖间糖苷键,低浓度 VC的加入可增加自由基的数量,多糖的降解速率明显提高810,但其对柘果多糖的降解是否有效未有报道。本研究以柘木果实为原料,采用 H2O2/VC降解法制备低分子量的柘果多糖,采用单因素实验,找到最适合柘果多糖降解的条件,以期建立一种快速、有效、最大利用程度的柘果低分子量多糖的制备方法。并对降解前后的多糖进行了分子量、单糖组成、红外光谱及抗氧化活性的比较研究,突出低分子量柘果多糖在抗氧化活性
16、方面的优势,为低分子量柘果多糖的应用研究提供理论依据。1材料与方法 1.1材料与仪器柘果2022 年 4 月采自浙江湖州长兴县;洗净后,置于鼓风干燥箱 80 烘干,高速粉碎机粉碎,过筛(60 目)得柘果粉;H2O2(30%)、维生素 C(VC,500 g/瓶)、1,1-二 苯 基-2-三 硝 基 苯 肼(DPPH,250 mg/瓶)、硫酸亚铁(分析纯)、磷酸钠(分析纯)、七水合钼酸铵(分析纯)、水杨酸(分析纯)、铁氰化钾(分析纯)国药集团化学试剂有限公司;葡聚糖标准品,分子量范围为 1.5200 kDa北京海富达科技有限公司。A-000274 乌氏粘度计江苏翌哲实验仪器有限公司;HH-2 型恒
17、温水浴锅北京科伟永兴仪图有限公司;LC210 型高效液相色谱仪、TSK G4000PWxl(Japan)色谱柱上海仪电分析仪器有限公司;LC-LX-LF50D 型冷冻高速离心机力辰科技有限公司;SHZ-D()型循环水式真空泵上海尚仪仪器有限公司;T2600S 型紫外分光光度计青岛精诚仪器仪表有限公司;DSA800 傅里叶变换红外光谱仪河南奥普斯仪器设备有限公司;A01 型冷冻干燥机郑州冰雪时代设备有限公司;GI-5000 离子色谱仪深圳通瑞色谱仪器有限公司;FW100 高速粉碎机苏州江东精密仪器有限公司;KQ-500E 超声波破碎仪北京中仪汇丰科技有限公司;DDBJ-350 电导率仪上海仪电科
18、学仪器股份有限公司。1.2实验方法 1.2.1 柘果粗多糖的提取取一定量磨碎过筛的柘果粉末,加入 20 倍体积无水乙醇,70 回流提取 2 h,除去脂类、黄酮、多酚等醇溶性杂质,冷却后过滤、80 烘箱干燥得脱脂除杂柘果粉末。取 100 g 脱脂柘果粉末,加入 2000 mL 去离子水,充分混匀,置于容器中超声波破碎 20 min(超声功率 300 W),98 水浴加热搅拌提取 2 h,滤渣重复提取 2 h,合并两次滤液并离心(4000 r/min 离心 10 min)。上清液使用硅藻土助滤,取滤液装于 3000 Da 透析袋中,蒸馏水透析,电导率仪检测其电导率值(小于 30 S/cm),并减压
19、浓缩至多少 200 mL。浓缩液用 95%乙醇沉淀,4 静置过夜,离心(4000 r/min 离心 10 min)后将沉淀溶于适量超纯水中,再用 Sevage 法去除游离蛋白质,将水相溶液浓缩冻干,得到棕褐色粉末状柘果粗多糖 ZGA11。精确称重计算多糖得率,并以葡萄糖 40 食品工业科技2023 年 10 月为标准品,采用苯酚-硫酸法测定 ZGA 中的总糖含量5。1.2.2 多糖降解条件的筛选精准称取降解所需浓度的抗坏血酸,溶于少量蒸馏水中,并量取所需浓度的过氧化氢,二者同时加入到待降解的多糖溶液中,磁力搅拌器搅拌 20 min,溶液粘度趋于稳定,降解完成。1.2.2.1 H2O2与 VC比
20、例的确定为了确定 H2O2与VC两种试剂的比例浓度对柘果多糖的降解的影响,采用单因素实验方法,在室温下将实验分为两组,浓度比例如表 1 所示,分别共同作用于多糖溶液,并绘制降解曲线,纵坐标为糖溶液的特性粘度,横坐标为降解试剂的浓度比例,来检验两种试剂的浓度比例对降解反应的影响。表 1 过氧化氢与抗坏血酸的浓度比例Table 1 Concentration ratio of hydrogen peroxideto ascorbic acid第一组第二组H2O2(mmol/L)151020401010101010VC(mmol/L)101010101035101520 1.2.2.2 H2O2与
21、VC浓度的确定在对两种试剂的比例进行检验之后,选择较适宜的比例,重复使用1.2.2 的方法以特性粘度为主要指标(分子量越低特性粘度越低),降解程度为参考指标,来确定两个试剂浓度对降解反应的影响(具体试剂浓度见表 2),分别降解 ZGB、ZGC、ZGD、ZGE、ZGF 五个多糖产品。1.2.2.3 降解产品特性粘度的计算多糖的分子量与其溶液的特性粘度有关,使用乌氏粘度计测定溶液的流出时间,计算相对粘度,以降解后溶液的特性粘度为评价指标,并计算不同比例与浓度的试剂对柘果多糖降解程度,以选择较适宜的降解条件12。特性粘度和降解率按如下公式(1)、(2)、(3)、(4)计算:r=tst0式(1)sp=
22、r1式(2)t=2(spr)c式(3)降解率(%)=0t0100式(4)rspt0式中:ts为溶液流出的时间,s;t0为溶剂流出的时间,s;为相对粘度;为增量粘度;c 为柘果多糖溶液的浓度,g/mL;和分别为柘果多糖溶液的特性粘度和溶剂的特性粘度。1.2.2.4 降解产品的制备按照表 2 所示的试剂浓度降解,将降解后的多糖溶液分别装于 500 Da 透析袋中,蒸馏水透析 3 d,电导率仪检测电导率小于30 S/cm 后减压浓缩至挂壁。浓缩液用 95%乙醇沉淀,将沉淀烘干得 ZGB、ZGC、ZGD、ZGE、ZGF五个不同分子量的柘果多糖产品。1.2.3 柘果粗多糖及降解多糖的理化性质分析 1.2
23、.3.1 多糖分子量的测定通过高效液相色谱法测定多糖分子量和纯度13。精密称取标准品和各样品,样品配制成 0.5%的溶液,12000 r/min 离心10 min,上清液用微孔滤膜过滤后转置于进样瓶中。色谱柱:BRT105-104-102 串联凝胶柱;流动相:0.05 mol/L 氯化钠溶液;流速:0.6 mL/min,柱温:40;进样量:20 L;检测器:示差检测器 RI-10A。1.2.3.2 红外光谱测定通过 FT-IR 分析多糖的官能团14。精密称取样品 5 mg 和溴化钾 500 mg,混匀研磨成细粉,并压制成片,单独使用溴化钾粉末压片作为空白对照。分别置于傅里叶变换红外光谱仪DSA
24、800 在 4004000 cm1进行红外光谱扫描记录。1.2.3.3 单糖组成的测定使用离子色谱仪测定单糖组成。按照文献的方法15取 16 种单糖的标准溶液配制成标准品作为混标,测定不同单糖质量并计算出摩尔比。精密称量 5 mg 样品置于安瓿瓶中,加入3 mol/L TFA 2 mL,120 水解 3 h。吸取酸水解溶液转移至管中氮吹吹干,加入 5 mL 水涡旋混匀,吸取50 L 加入950 L 去离子水,12000 r/min 离心5 min。取上清进 IC 分析。色谱柱条件:Dionex CarbopacTMPA20(3150 mm);流动相条件:A:H2O;B:15 mmol/LNaO
25、H;C:15 mmol/L NaOH&100 mmol/L NaOAC。流速:0.3 mL/min;进样量:5 L;柱温:30;检测器:电化学检测器。1.2.4 柘果粗多糖及降解多糖的抗氧化活性研究 1.2.4.1 总抗氧化能力配制 5.0 mg/mL 柘果多糖溶液,取 5 支试管作为样品组,每管分别加入(50、100、150、200、300 L)样品溶液,并用蒸馏水补足至 1 mL。另取 1 支试管加入 1 mL 蒸馏水作为空白调零。依次向各试管中加入钼酸铵反应溶液 4 mL,95 水浴加热 100 min,冰水浴冷却后于 695 nm 波长下测定吸光度值,吸光度值表示样品的总抗氧化能力16
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- 分子量 多糖 制备 及其 氧化 活性 研究