丁香酚增强MSCs对肝星状细胞炎性活化的抑制作用.pdf
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1、第 44卷 第5期2023 年 9月Vol.44 No.5September 2023中山大学学报(医学科学版)JOURNAL OF SUN YATSEN UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCES)丁香酚增强MSCs对肝星状细胞炎性活化的抑制作用吴逐宇1,汪显耀1,陈艳2,何志旭3(1.遵义医科大学免疫学教研室,贵州 遵义 563099;2.贵州省儿童医院/遵义医科大学附属医院小儿内科,贵州 遵义 563099;3.遵义医科大学/教育部组织损伤与再生医学协同创新中心,贵州 遵义 563099)摘要:【目的】研究丁香酚对人脐带间充质干细胞(HUC-MSCs)抑制肝星状细胞(HSCs
2、)炎性活化以及巨噬细胞促炎表型作用的影响及其相关机制;【方法】体外培养并鉴定HUC-MSCs,并采用MTT法评估丁香酚对HUC-MSCs的毒力作用;体外划痕实验探究丁香酚对HUC-MSCs迁移能力的影响;丁香酚处理HUC-MSCs后的旁分泌产物(EU-MSCs-CM)、HUC-MSCs旁分泌产物(MSCs-CM)处理经TGF-1处理活化的LX-2细胞,WB实验检测LX-2的-SMA、COL1A1、Smad2/3、p-Smad2/3表达的变化。EU-MSCs-CM、MSCs-CM处理经脂多糖(LPS)诱导的THP-1巨噬细胞,流式细胞术检测THP-1巨噬细胞表面标志物CD11b、CD86、CD2
3、06的表达情况,qPCR检测THP-1巨噬细胞促炎基因TNF-、IL-1、IL-6的表达情况。【结果】MTT法结果显示在0、7.5、15 g/mL浓度处理细胞24 h、48 h后,细胞活力保持在90%以上;体外划痕显示,丁香酚处理可以增强HUC-MSCs迁移能力。WB结果显示,与MSCs-CM处理相比,EU-MSCs-CM处理对活化状态的HSCs的-SMA、COL1A1、Smad2/3、p-Smad2/3表达抑制作用更加显著。流式细胞术实验结果显示,与MSCs-CM处理,EU-MSCs-CM处理对THP-1巨噬细胞M1型极化标志物CD86的抑制作用更加显著;qPCR实验结果显示,与MSCs-C
4、M处理,EU-MSCs-CM处理更加显著的抑制THP-1巨噬细胞促炎基因TNF-、IL-1、IL-6的表达。【结论】丁香酚增强了HUC-MSCs对HSCs炎性活化抑制作用,可能是通过调节TGF-1/Smads信号通路抑制HSCs的活化;丁香酚增强了HUC-MSCs对巨噬细胞促炎表型的抑制作用;促炎表型巨噬细胞可以促进HSCs炎性活化。关键词:人脐带间充质干细胞;肝纤维化;肝星状细胞;巨噬细胞;条件培养基中图分类号:R392.9 文献标志码:A 文章编号:1672-3554(2023)05-0784-08DOI:10.13471/ki.j.sun.yat-sen.univ(med.sci).20
5、23.0509Experimental Study on the Inhibitory Effect of Eugenol on Inflammatory Activation of Hepatic Stellate Cells by MSCsWU Zhu-yu1,WANG Xian-yao1,CHEN Yan2,HE Zhi-xu3(1.Department of Immunology,Zunyi Medical University,Zunyi 563099,Guizhou,2.Department of Pediatric Medicine,Guizhou Childrens Hospi
6、tal/Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi 563099,China;3.Collaborative Innovation Center of Tissue Injury and Regenerative Medicine,co-sponsored by the Chinese Ministry of Education/Zunyi Medical University,Zunyi 563099,China)Correspondence to:HE Zhi-xu;E-mail:Abstract:【Objective】Thi
7、s study aimed to investigate the effects of eugenol on inhibiting the inflammatory activation of human umbilical cord mesenchymal stem cells(HUC-MSCs)and the pro-inflammatory phenotype of hepatic stellate cells(HSCs)in liver fibrosis,and to explore their underlying mechanisms.【Methods】HUC-MSCs were
8、cultured and identified in vitro,and the toxicity of eugenol to HUC-MSCs was evaluated by MTT method.The effect of eugenol on the migration ability of HUC-MSCs was investigated by in vitro scratch test.The expression of-SMA,COL1A1,Smad2/3 and p-基础研究 收稿日期:2023-03-17基金项目:省部共建协同创新中心项目(教科厅函 2020 39)作者简介
9、:吴逐宇,第一作者,E-mail:;何志旭,教授,博士生导师,研究方向:干细胞研究,E-mail:第5期吴逐宇,等.丁香酚增强MSCs对肝星状细胞炎性活化的抑制作用Smad2/3 of LX-2 cells activated by TGF-1 treated with EU-MSCs-CM and MSCs-CM were detected by WB assay.EU-MSCs-CM and MSCs-CM treated THP-1 macrophages stimulated with Lipopolysaccharide(LPS)were analyzed for the expre
10、ssion of surface markers CD11b,CD86,and CD206 by flow cytometry.Additionally,the expression of pro-inflammatory genes TNF-,IL-1,and IL-6 in THP-1 macrophages was detected by qPCR.【Results】The results of MTT method showed that the viability of the cells remained above 90%after 24 h and 48 h treatment
11、 at 0,7.5,15 g/mL.In vitro scratches showed that eugenol treatment enhanced HUC-MSCs migration.WB results showed that compared with MSCs-CM treatment,EU-MSCs-CM treatment significantly inhibited the expression of-SMA,COL1A1,Smad2/3,and p-Smad2/3 of activated HSCs.Flow cytometry showed that compared
12、with MSCs-CM treatment,EU-MSCs-CM treatment had a more significant inhibitory effect on CD86,a M1-type polarization marker in THP-1 macrophages.The results of qPCR experiment showed that compared with MSCs-CM treatment,EU-MSCs-CM treatment more significantly inhibited the expressions of TNF-,IL-1 an
13、d IL-6 of THP-1 macrophage proinflammatory genes.【Conclusions】Eugenol enhances the inhibitory effect of HUC-MSCs on inflammatory activation of HSCs,possibly by regulating TGF-1/Smads signaling pathway.It also enhances the inhibitory effect of HUC-MSCs on the pro-inflammatory phenotype of macrophages
14、.Proinflammatory macrophages can promote inflammatory activation of HSCs.Key words:human umbilical cord mesenchymal stem cells;liver fibrosis;hepatic stellate cells;macrophage;conditioned mediumJ SUN Yatsen Univ(Med Sci),2023,44(5):784-791肝纤维化是由各种致病因素(如酒精、病毒、自身免疫性疾病等)造成的慢性肝脏损伤演变而来1,流行病学数据显示,全球每年有超过1
15、00万人死于肝纤维化相关疾病2。HSCs活化过度产生细胞外基质是肝纤维化的主要特征性事件3,转化生长因子-1(transforming growth factor-1,TGF-1)具有很强的促纤维化活性,可以刺激静止状态HSCs活化,分泌大量一型胶原蛋白(COL1A1,Type 1 collagen)、-平滑肌肌动蛋白(-smooth muscle actin,-SMA)等细胞外基质4。在肝损伤时,活化的HSCs分泌TGF-1,通过Smad2/Smad3形成正反馈环路促进纤维化形成,而Smad7则是该途径的抑制因子5-7。当肝脏发生炎症时,活化的肝脏内的巨噬细胞(Kupffer cells,K
16、Cs)通过释放各种细胞因子如 TNF-、IL-1、IL-6 等,诱导静止状态 HSCs活化8-9,M1型巨噬细胞在肝纤维化进展期发挥促炎和促纤维化的作用;而M2型巨噬细胞可以在肝纤维化恢复期发挥抗炎和抗纤维化作用10。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有自我更新能力、趋化迁移特性和跨胚层分化潜能等特性,是组织工程的理想种子细胞11。MSCs通过旁分泌产生多种细胞因子,这些旁分泌因子具有调节免疫反应、促进血管生成、促进组织修复和再生等作用12,通常将这种含有大量细胞因子及生长因子的培养基称为条件培养基(conditioned medium,CM)13。新近报
17、道显示,在暴发性肝衰竭大鼠模型中,MSCs-CM对肝细胞死亡有直接抑制作用,对肝细胞再生有促进作用14。有学者发现肝纤维化小鼠注射MSCs-CM可以抑制肝细胞凋亡、促进其再生,抑制中性粒细胞浸润和KCS激活15。值得注意的是,通过不同方法(包括药物处理、促炎细胞因子刺激、缺氧处理等)处理MSCs可以调节其生物学功能(比如:自我更新、迁移和分化潜能等)16-17。丁香酚是一种具有广泛药理作用的化合物,在过去的十年中受到了广泛的关注,具有抗氧化、抗炎、免疫调节等作用18-19。有研究发现用丁香酚处理小鼠骨髓 MSCs,通过上调 Sox2、Rex1 和 Tex10 来增强MSCs增殖以及自我更新能力
18、20。作为前人研究成果的延伸,本研究旨在探究丁香酚对HUC-MSCs抑制肝纤维化进展的关键因素(HSCs炎性活化)作用的影响。1 材料与方法1.1HUC-MSCs的分离培养及鉴定。脐带组织取自遵义医科大学附属医院产科,健康足月新生儿,经过产妇知情同意,产妇乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋、梅毒等检查均为阴性;采集好标本后,将其放入含 2%双抗的 DMEM培养基中,低温运送至细胞间无菌超净台进行后续分离培养。在超净台中用无菌PBS清洗脐带并去除两根脐静脉和一根脐动脉,分离出脐带中的华通氏胶组织并剪785第44卷中山大学学报(医学科学版)碎,铺于T75细胞培养瓶中,加入90%DMEM低糖培养基(Gibco
19、,USA)、10%FBS(USA,New Zealand)和 1%双抗(Gibco,USA),在 37C,体积分数 5%CO2湿度培养箱中培养,定期更换培养基。培养7 d可见 HUC-MSCs 逐渐从组织块中爬出,到 80%-85%融合度时,用胰蛋白酶化,传代至第四代,然后将细胞制备为细胞悬液以待使用。通过流式细胞 术 鉴 定 HUC-MSCs,鉴 定 HUC-MSCs 表 面 的MSCs 标志物(CD73、CD90、CD105)和造血标志物(CD34、CD45、CD19、CD11b、HLA-DR)。1.2MTT检测细胞活力为了评估丁香酚对HUC-MSCs的细胞活力的影响,将HUC-MSCs铺
20、在96孔板(5103 cells/well)中,12 h后,用不同浓度(0、7.5、15、30、60、120、240 g/mL)的丁香酚处理HUC-MSCs,24 h和48 h后,小心吸去上清,加入 90 L新鲜培养液,再加入10 L MTT(Solarbio,China)溶液,继续培养 4 h;然后吸掉上清,每孔加入110 L Formazan 溶解液,置摇床上低速震荡10 min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm 处测量各孔的吸光值。1.3体外划痕实验为了评估丁香酚对HUC-MSCs迁移能力的影响,将2105 cells/well HUC-MSCs接种在六孔板中,12 h后,
21、当HUC-MSCs贴壁后,使用200 L枪头尖端从细胞单层中心垂直划痕,然后用PBS清洗以去除刮下的细胞。用含 10%FBS的 DMEM 2 mL,丁香酚15 g/mL,37 C,体积分数5%CO2,处理细胞24 h;通过倒置显微镜观察HUC-MSCs从划痕边缘迁移到中央区域并拍照,在Image J软件中进行分析,来评估细胞的迁移能力。1.4条件培养基的制备将HUC-MSCs铺在6孔板中加入完全培养基,待到细胞融合度70%时加入15 g/mL丁香酚处理细胞24 h,然后将完全培养基换成DMEM基础培养基继续培养细胞 24 h,然后吸取上清,在 4C、1 000g 下离心 10 min,吸取上清
22、即为 Eu-MSCs-CM,在-80 保存,以备后续使用。对照组不丁香酚处理HUC-MSCs,其余操作步骤一致。1.5Western Blotting 实验将收集到的细胞,通过添加1:100蛋白酶抑制剂(Solarbio,China)的 RIPA 裂解液(强)(Solarbio,China)裂解细胞。采用 BCA蛋白检测试剂盒(Solarbio,China)进 行 蛋 白 定 量。样 品 通 过 SDS-PAGE凝胶分离,转移到PVDF膜(Millipore)上。用5%脱 脂 牛 奶 封 闭 膜 2 h,4 下 用 一 抗:anti-COL1A1(1:2 000,ab138492,abcam)
23、、anti-SMA(1 g/mL,ab5694,abcam)、anti-Smad2/3(1:1 000,ab202445,abcam)、anti-p-Smad2/3(1:1 000,ab254407,abcam)、GAPDH(1:2 000,GB11002,Servicebio)孵育过夜。清洗3次后,用酶标兔二抗在室温下孵育2 h。使用Immobilon Western HRP(GeneBank;USA)曝光;并用Image J软件中进行分析。1.6流式细胞术分析收集THP-1细胞,PBS重悬。加入流式细胞抗体 CD86(invitrogen,2400629,USA)、CD11b(invitr
24、ogen,2414642,USA)和 CD206(invitrogen,2344972,USA),在室温下黑暗孵育 30 min,然后用 PBS 清洗。最后用流式细胞仪检测。1.7实时荧光定量PCR(qRT-PCR)向THP-1巨噬细胞中加入1mL TRNzol(Takara,Japan)提取总RNA,然后,用RT Master Mix将提取的RNA反向转化为cDNA进行qPCR(Takara,Japan)。Real-time PCR 采用 Applied Biosystems ViiA6 Real-time PCR 系统,采用 SYBR Green qPCR Master Mix(Takar
25、a,Japan)。PCR引物序列:TNF-:FORWARD:AGC TGG TGG TGC CAT CAG AGG,REVERSE:TGG TAG GAG ACG GCG ATG CG;IL-1:FORWARD:TGG CTT ATT ACA GTG GCA ATG AGG ATG,REVERSE:TGT AGT GGT GGT CGG AGA TTC GTA;IL-6:FORWARD:GGT GTT GCC TGC TGC CTT CCG,REVERSE:GTT CTG AAG AGG TGA GTG GCT GTC。1.8统计学分析数据数值均采用均数标准差表示。数据处理两样本间比较采用t检
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