电针激活CB2受体增强细胞自噬功能缓解炎性痛的机制.pdf
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1、2023 第二十五卷 第六期 Vol.25 No.6 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 电针激活CB2受体增强细胞自噬功能缓解炎性痛的机制武彩花1,高芳2,向宏春2,蓝渝叶2,万科幸2,高珊1,杨金梅1,李熳2,毛红蓉1(1.武汉市第一医院 武汉 430030;2.华中科技大学同济医学院 武汉 430030)摘要:目的观察电针对野生型小鼠和内源性大麻素2型受体(Canabinoid receptor 2,CB2受体)基因敲除小鼠完全弗氏佐剂(
2、Complete Freund s adjuvant,CFA)诱导的炎性痛的缓解作用和炎症皮肤组织中细胞自噬功能的影响;激活CB2受体模拟电针作用,观察其对NR8383巨噬细胞自噬功能以及线粒体受损情况的影响,探讨电针能否通过激活CB2受体增强炎症皮肤组织自噬功能并清除受损线粒体从而缓解炎性痛。方法采用热板测痛法测定小鼠的热痛阈;采用von Frey丝,以“up and down”方法测定小鼠机械痛阈;采用Western blot检测野生型和CB2受体基因敲除小鼠足背皮肤组织中自噬相关蛋白p62和微管相关蛋白轻链3(light chain 3,LC3)的表达及NR8383巨噬细胞中p62和LC
3、3的表达;采用流式细胞术检测受损线粒体的数量。结果CFA诱导炎性痛模型的野生型小鼠和CB2受体基因敲除小鼠的热痛阈值和机械痛觉阈值均较溶媒对照组显著下降(P0.01);电针可显著提高野生型炎性痛模型小鼠的热痛阈值和机械痛阈值(P0.05)。电针可翻转炎性痛模型的野生型小鼠炎症皮肤组织中自噬相关蛋白p62表达增加和LC3-/比值降低,从而促进炎症皮肤组织中细胞自噬功能,而对CB2受体基因敲除炎性痛模型小鼠无影响;采用CB2受体激动剂AM1241激活NR8383巨噬细胞中CB2受体可减少p62蛋白表达,升高LC3-/比值,从而改善CFA引起的自噬功能减弱,该作用可被CB2受体拮抗剂AM630所翻转
4、;采用CB2受体激动剂AM1241激活NR8383巨噬细胞中CB2受体可减少受损线粒体的数量,该作用可被CB2受体拮抗剂AM630所翻转,提示CB2受体的激活能促进巨噬细胞的自噬作用,从而清除受损的线粒体。结论电针通过激活CB2受体,增强炎症皮肤组织细胞自噬功能,清除受损的线粒体,从而缓解炎性痛。关键词:电针 内源性大麻素2型受体 炎性痛 自噬 线粒体doi:10.11842/wst.20220617003 中图分类号:R245.3 文献标识码:A炎性痛通常由组织损伤与炎症一起发生,广泛存在于各种急、慢性疾病的进程中,当炎症反应继续存在,这种疼痛就会持续存在1-2,严重影响患者生活质量。研究表
5、明,细胞自噬与炎症反应之间存在着密切联系3,自噬能通过清除受损的线粒体,进而抑制炎症小体的激活以及白介素-1(Interleukin-1,IL-1)的分泌4。自噬是一种胞内膜转运系统5,控制着物质向溶酶体转运,使有缺陷的细胞器、错误折叠的蛋白质等物质降解6,以维持细胞稳态7。已有研究表明,电针治疗炎性痛疾病具有消炎、镇痛的作用8-10,前期工作表明,电针能通过上调外周内源性大麻素含量,激活 CB2 受体,进而显著下调大鼠炎症皮肤组织中IL-等致炎细胞因子的表达,从而发挥消炎、镇痛作用11-13。而电针能否通过激活炎性痛病灶皮肤组织中 收稿日期:2022-06-17 修回日期:2022-09-0
6、3 国家自然科学基金委员会面上项目(81973949),负责人:李熳;武汉市中青年医学骨干人才项目,负责人:武彩花。通讯作者:毛红蓉,主任医师,硕士生导师,主要研究方向:针灸调节神经、内分泌及免疫功能的研究。2036 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化基于中药作用的细胞研究的CB2受体,增强其炎症皮肤组织细胞自噬功能,促进受损线粒体的清除,从而发挥镇痛作用,目前尚不清楚。本研究首先观察电针对野生型小鼠和CB2受体基因
7、敲除小鼠CFA诱导炎性痛的缓解作用和炎症皮肤组织细胞自噬功能的影响,激活CB2受体模拟电针作用,观察其对NR8383巨噬细胞自噬功能以及线粒体受损情况的影响,探讨电针能否通过激活CB2受体增强炎症皮肤组织细胞自噬功能以及促进受损线粒体的清除从而缓解炎性痛。1 材料与方法 1.1实验动物CB2受体基因敲除小鼠购于Jackson实验室(货号005786)。小鼠饲养于华中科技大学同济医学院实验动物中心SPF级动物房,4周龄时打耳标并剪尾,提取尾组织DNA,采用PCR进行基因型的鉴定,鉴定方法依据Buckley等14的文献报道。引物序列见表1。PCR反应温度体系为:95反应1 min;60反应1 mi
8、n,72反应2 min,共30个循环;72延伸10 min。实验采用健康野生型(Wild type,WT)为CB2基因敲除小鼠同窝,鉴定方法同上,为阴性,以下简称野生型小鼠。1.2动物模型动物模型实验中的所有动物操作及方案均经过华中科技大学同济医学院动物伦理委员会批准。实验小鼠饲养条件:环境洁净,室内温度222、12 h白昼/12 h黑夜自动交替的动物房,饮食自由。在实验前驯养适应1周,野生型小鼠和CB2受体基因敲除小鼠均随机分为:溶媒对照组(control组)、CFA模型组(CFA模型组)、电针组(CFA+EA 组)和假电针组(CFA+sham EA组),每组8只。其中CFA模型组、电针组和
9、假电针组在小鼠左后肢足背皮下注射50 L CFA诱导炎性痛模型,溶媒对照组在同部位注射50 L石蜡油;电针组小鼠在造模后第2、4、6天,采用LH202H型韩氏穴位电针仪针刺小鼠的左侧胆经“环跳穴”(GB30)和“阳陵泉穴”(GB34),电针参数为:电流强度1 mA,频率2 Hz,刺激 30 min;假电针组仅将毫针刺入相同穴位,不通电,留针30 min。1.3痛行为学检测采用热板测痛法测定小鼠热痛阈值。在室温为25-27的安静环境中,设置热板温度为55,将小鼠放入热板上,同时开始计时,小鼠出现缩腿或舔爪信号时停止计时,并及时取出小鼠避免烫伤,每只小鼠测3次后取平均值,每次间隔5 min。采用v
10、on Frey丝(Stoelting,Wood Dale,IL),以“up and down”方法15测定小鼠机械痛阈。在室温25-27的安静环境中,采用双盲实验方法,将小鼠置于底为5 mm 5 mm的金属丝网眼垫的透明有机玻璃箱中,适应 20-30 min,等其安静后测定机械痛阈。将校准的von Frey丝垂直地作用于小鼠左后肢足底,稍用力,直至其弯曲成S形,每次持续时间最长不超过6 s,小鼠出现快速的缩足反射或舔足反应,则记为阳性反应。每次测试重复2次,计算平均值。造模前所有小鼠连续测定3天基础痛阈,造模后连续测6天。1.4细胞培养采用的NR 8383来源于肺灌洗时的正常大鼠肺泡巨噬细胞,
11、购于武汉普诺赛生命科技有限公司。用含20%胎牛血清(Biological Industries 公司,以色列)及1%双抗(Gibco 公司,美国)的 DMEM 高糖培养基(Gibco 公司,美国)于 37、5%CO2细胞培养箱中培养,待细胞融合度至90%以上后进行传代培养。NR 8383为贴壁和悬浮混合状态生长的细胞,其传代方法为直接用移液器吹打细胞,将其从培养瓶底部吹下来,收集细胞悬液至15 mL离心管中,室温800 rmin-1转速离心5 min,弃掉上清,加入新鲜培养基,轻轻吹打重悬细胞,以1 2的比例将细胞种于新的培养瓶中。1.5Western blot检测p62、LC3B蛋白表达检测
12、各组小鼠p62、LC3B蛋白表达。取制备的皮肤组织及收集的细胞悬液,提取总蛋白,使用加强型BCA试剂盒(碧云天)测定蛋白浓度。取80 g总蛋白上样,采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(80V,恒压2 h)。电泳结束后切取目的条带,将目的条带转至PVDF膜上,200 mA恒流转膜。转膜完毕后,取出PVDF膜,封闭1 h后,4孵育一抗(兔抗p62、兔抗LC3B)过夜。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗(1 20 000)后表1基因引物序列Gene-actinCB2primersSense:5-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3Antisense:5-CCCATACCCACCATCACAC
13、C-3Primer:1,5 AAATGCTTGATTGGTGTCAGCTCTC3Primer:2,5 GGCTCCTAGGTGGTTTTCACATCAGCCTCT3Primer:3,5 TAAAGCGCATGCTCCAGACTGCCTT32037 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第六期 Vol.25 No.6 室温孵育 1 h,在暗室用 ECL 化学发光显色液显色5 min,压胶片,取出胶片并依次放入显影液、定影液中显
14、影。将胶片洗净晾干后扫描,使用Image J对条带进行灰度分析。Western blot 实验所用一抗有兔抗 p62(1 1000),购于Cell Signaling;兔抗LC3B(1:1000),购于 Cell Signaling;小鼠抗-actin(1:4000),购于 Santa Cruz;使用的二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠/羊抗兔IgG(1 20000),购于Jackson ImmunoResearch。1.6流式细胞术受损线粒体检测:NR8383细胞加药处理完成后,避光操作,加入线粒体染料MitoTracker Green(绿色荧光可染所有的线粒体,100 nmolL-1)和
15、MitoTracker deep Red(红色荧光,依赖于线粒体的膜电位,只能染有 活 性 的 线 粒 体,100 nmolL-1)(均 购 于 Life Technology),于37孵育30 min;吹打细胞,收集细胞悬液,室温用 800 rmin-1转速离心 5 min,弃上清;加1 mL PBS 37洗涤细胞2次,每次5 min,再离心弃上清;加入300 L PBS重悬细胞,上流式细胞仪进行分析,使用FlowJo 7.6.2软件分析结果并作图。线粒体活性氧(Reactive oxygen species,ROS)检测:NR8383细胞加药处理完成后,避光操作,加入线粒体相关ROS染料M
16、itoSOX(MitoSOXRed,线粒体超氧化物指示剂,Invitrogen 公司,Thermo Fisher Scientific Inc)对细胞进行2.5 molL-1染色,于37孵育30 min;用PBS溶液洗涤细胞3次,再悬浮在含1%胎牛血清的冷PBS溶液中,上流式细胞仪进行分析。使用FlowJo 7.6.2软件分析结果并作图。1.7数据分析数据均以均数标准误(meansSEM)表示,采用单因素方差分析和LSD(最小显著差异)和S-N-K方差后分析来检测各组的统计差异,分析均在SPSS(11.5版)程序中进行,P0.05表示差异具有统计学意义2 结果 2.1电针显著改善野生型炎性痛模
17、型小鼠热痛觉过敏和机械痛觉超敏与溶媒对照组相比,野生型小鼠CFA造模后第1天各组热痛阈、机械痛阈值均较溶媒对照组显著下降(P0.01,图1A、1C);与CFA模型组相比,给予2 Hz电针治疗后,电针组的热痛阈在第3-6天均显著回升(P0.05,图1A),电针组的机械痛阈值在第2-6天均显著回升(P0.05)。说明电针可显著改善炎性痛模型野生型小鼠的热痛觉过敏和机械痛觉超敏。图1电针对野生型和CB2受体基因敲除小鼠热痛阈值和机械痛觉阈值的影响(meansSEM,n=8)注:A、B分别为野生型小鼠和CB2受体基因敲除小鼠各组小鼠热痛阈值;C、D分别为野生型小鼠和CB2受体基因敲除小鼠各组小鼠机械痛
18、阈值。小鼠随机分为溶媒对照组、CFA模型组、CFA模型+2 Hz EA组、CFA模型+sham EA组,箭头所指为给予电针的时间。与溶媒对照组比较,*P0.01;与CFA模型组比较,#P0.05。2038 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化基于中药作用的细胞研究与溶媒对照组相比,CB2受体基因敲除小鼠造模后第 1 天各组热痛阈、机械痛阈值均显著下降(P0.05,图1B、1D)。以上结果提示,电针通过激活CB2受体缓解
19、CFA诱导的炎性痛。2.2电针显著改善野生型炎性痛模型小鼠炎症皮肤组织细胞中自噬功能在野生型小鼠皮肤组织中,CFA模型组p62蛋白表达较溶媒对照组显著升高,LC3-/比值显著下降(P0.05,图2A、2B、2D),与CFA模型组比较,电针组p62蛋白水平显著下降,LC3-/比值显著上升(P0.05)。以上结果提示,CFA诱发炎性痛时小鼠皮肤组织中自噬减弱,而给予电针治疗后可促进自噬功能。在CB2受体基因敲除小鼠皮肤组织中,与溶媒对照组相比,CFA模型组p62蛋白表达显著升高,LC3-/的比值显著下降(P0.05)。以上结果表明,电针促进炎症皮肤组织的自噬功能依赖于CB2受体的参与。2.3在NR
20、8383巨噬细胞中激活CB2受体可改善CFA引起的自噬功能减弱与 DMSO 对照组相比,给予 CFA 处理后会导致NR8383细胞自噬底物 p62蛋白表达显著升高,LC3-/的比值显著降低(P0.05,图3),提示CFA显著抑制NR8383巨噬细胞的自噬功能;采用CB2受体激动剂AM1241预处理再加入CFA后,NR8383巨噬细胞中p62蛋白表达显著下调,LC3-/比值显著升高(P0.05,图3),CB2受体拮抗剂AM630可逆转上述作用。以上结果提示:CB2受体激活剂AM1241可显著改善CFA引起的NR8383巨噬细胞自噬功能障碍,该作用图2电针对野生型和CB2受体基因敲除小鼠炎症皮肤组
21、织中p62蛋白表达,LC3-/比值的影响(meansSEM,n=8)注:A为野生型小鼠和CB2敲除小鼠各组皮肤组织中p62、LC3-/蛋白表达的影响;B、D为野生型小鼠各组皮肤组织中p62蛋白相对表达量,LC3-/比值;C、E为CB2基因敲除小鼠各组皮肤组织中p62蛋白相对表达量、LC3-/比值。与溶媒对照组比较,*P0.01;与CFA模型组比较,#P0.05。2039 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第六期 Vol.
22、25 No.6 图3CB2受体激动剂AM1241对CFA处理后NR8383巨噬细胞自噬功能的调节作用(meansSEM,n=8)注:A为大鼠NR8383巨噬细胞分别经DMSO、CFA过夜、CFA处理前1 h给予AM1241、CFA处理前1 h给予AM1241+AM630后检测各组细胞中p62、LC3-、LC3-蛋白表达;B为各组p62蛋白相对表达量的柱状图;C为各组LC3-/比值的柱状图。与溶媒对照组比较,*P0.01;与CFA模型组比较,#P0.05。图4CB2受体激动剂AM1241对CFA处理后NR8383巨噬细胞中受损线粒体数量的影响(meansSEM,n=8)注:A为大鼠巨噬细胞NR8
23、383分别经DMSO、CFA处理24 h、CFA处理前1 h给予AM1241、CFA处理前1 h给予AM1241+AM630后各组给予红色和绿色染料预染30 min后进行流式细胞检测;B为大鼠巨噬细胞NR8383分别经DMSO、CFA处理24 h、CFA处理前1 h给予AM1241、CFA处理前1 h给予AM1241+AM630后各组给予MitoSOX染料预染30 min后进行流式细胞,检测各组P2区受损线粒体数量占总线粒体数量的比值;C为各组P2区细胞占NR8383细胞总数的比例;D为各组线粒体ROS含量。与溶媒对照组比较,*P0.01;与CFA模型组比较,#P0.05。2040 Moder
24、nization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化基于中药作用的细胞研究是由CB2受体介导的。2.4在NR8383巨噬细胞中激活CB2受体可减少线粒体受损的数量采用流式细胞术检测NR8383巨噬细胞中受损的线粒体。如图4A所示,P2区表示膜活性受损的线粒体,只染上绿色荧光。CFA可诱发膜活性受损的线粒体增多(P0.05,图4B);CB2受体激动剂AM1241预处理后,与CFA模型组相比,受损线粒体的数量显著减少,而CB2受体拮抗剂AM630可
25、逆转此作用。以上结果提示:CB2受体激活剂AM1241可明显减少受损线粒体的数量,该作用是CB2受体介导的。3 讨论 炎性痛是由于损伤或者感染的组织释放的炎症介质作用于痛觉神经末梢,增强其兴奋性,导致痛觉过敏的发生1,16。足部皮下注射CFA是一种常用的炎性痛模型17-18,被用来研究炎性疼痛。有研究表明自噬参与了炎症反应的调节作用,如能增强自噬作用,就可以清除体内更多的受损线粒体等细胞器,以实现细胞本身代谢需要和某些细胞器的更新,是机体的一种保护机制19-20,调节线粒体自噬或许成为一些疾病治疗新的方向。近来研究表明,自噬与炎性痛之间存在着密切联系21-22,炎症可以激活或抑制自噬,而自噬可
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