发光二极管630nm红光通过PI3K_AKT_mTOR通路抑制滑膜成纤维细胞炎症反应.pdf
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1、 年 月第 卷 第 期照明工程学报 .发光二极管 红光通过/通路抑制滑膜成纤维细胞炎症反应杜思琦 孟彩云 任丹丹 宋武琦 张凤民 刘海亮(哈尔滨医科大学伍连德研究所 哈尔滨医科大学微生物教研室 黑龙江省感染与免疫重点实验室 黑龙江 哈尔滨)摘 要:发光二极管()光照疗法是一种低能量光疗()在皮肤炎症治疗和术后疼痛缓解方面已被广泛研究 但其对类风湿性关节炎的作用及其机制尚不清楚 本研究采用 红光作为光源 以 刺激模拟炎症的类风湿关节炎患者组织中提取原代滑膜成纤维细胞(细胞)为模型 采用 和细胞划痕实验 检测不同剂量的 红光对炎症 细胞的活力 及其增殖和迁移的影响 采用 和 方法 检测、和 在细胞
2、中 表达及细胞上清中蛋白表达的变化 采用免疫印迹法 检测细胞中、和 蛋白表达和磷酸化的变化 结果证实 红光可抑制 细胞的增殖和迁移 降低细胞中、和 炎症因子的 表达水平 光照剂量为 /的 红光降低了 细胞中、和 蛋白的表达和磷酸化水平 结果证实 红光可以通过下调/信号通路以及减少炎症因子的释放 抑制 细胞的炎症反应及其增殖和迁移关键词:发光二极管 红光 类风湿关节炎/信号通路 滑膜细胞 低能量光疗中图分类号:文献标识码:基金项目:国家重点研发计划资助项目()国家自然科学基金项目()黑龙江省自然科学基金优秀青年项目()通信作者:刘海亮:/():().()().照明工程学报 年 月 /./.:/:
3、/引言类风湿性关节炎()是一种主要影响关节 尤其是滑膜关节的系统性自身免疫性疾病 主要表现为多个关节的慢性疼痛和肿胀 滑膜成纤维细胞作为 关节损伤的最终效应细胞 参与关节炎症和破坏 与晚期 的关节损伤密切相关 常用于体外探讨 的发病机制和筛选合适的临床药物 在目前许多治疗 的方法中 光疗已被用于治疗术后疼痛和炎症反应 既往研究利用类风湿关节炎滑膜成纤维细胞探索光疗机制 发现激光可抑制炎症因子的分泌 但这一结果的细胞分子机制尚不清楚 有待进一步研究光疗 中 的 光 生 物 调 节()是指通过激光或单色光的光辐射而非热效应对生物系统进行调节 它可以直接刺激或抑制生物功能 而不会造成不可逆的损害 与
4、基于光照激发外源传递发色团的光动力疗法不同 因其无创性 而更常用于基础研究和临床治疗在 光疗中 低能量光疗法()较为常用 主要光源是激光和发光二极管()其中 作为随着半导体技术的迅速发展而出现的一种新型光源具有操作简便、安全可靠等优点 而得到更加广泛的应用 由于红光与红外线相比 前者的热效应不明显 能更好地保护组织细胞免受热损伤 而且与短波长的光相比 具有更深的穿透性 可以深入骨骼和关节促进早期骨损伤的伤口愈合 因此 本研究选用 红光照射 以验证和探讨光生物调节对类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞的影响及其可能的机制材料和方法 细胞培养与 诱导炎症细胞模型从 患者身上提取原代滑膜成纤维细胞作为实验
5、对象 细胞在添加胎牛血清()和青霉素/链霉素溶液()的 中培养 培养的细胞在、环境中保存 终浓度为/的(公司)刺激滑膜细胞模拟炎症环境 发光二极管照射处理采用发光二极管 红光治疗仪(创盈光电医疗)进行细胞照射 细胞通过塑料培养板底部暴露在 红光照射下 每次照射所需时间分别为 、和 光照剂量分别为 /、/和/具体光源规格及参数见表 对于 刺激组在照射前需加入 /所有细胞均在生物安全柜内室温照射 对照组(非照射组)用铝箔包裹 细胞活力检测将 细胞(个/孔)接种到 孔板上 将细胞分成四组 分别暴露在、和/的 光照下 经照射处理后 采用 试剂(公司)检测细胞增殖 在每个孔中加入 (终浓度 /)孵育 使
6、用吸光度 仪(公司)测量 处的吸光度 以确定细胞的活力 细胞划痕实验将 细胞(个/孔)接种到 孔板上 待细胞密度至 时 使用灭菌的 枪头垂直划一条直线 无菌 去除细胞碎片 加入不含血清的 红光照射时间分别为 和 在 、的培养箱中进行培养 每 用 (放大倍数 )拍摄划痕愈合图像 使用 软件计算相同条件下的迁移距离 实时定量聚合酶链式反应()使用总 提取试剂盒(新海基因公司)从滑膜细胞中进行各样本 提取 等量的总 第 卷第 期 杜思琦等:发光二极管 红光通过/通路抑制滑膜成纤维细胞炎症反应 ()通过逆转录试剂盒(公司)进行逆转录 利用人基因特异性引物和反义引物 根据 上公布的序列 扩增促炎细胞因子
7、 见表 表 光生物调节参数 参数 规格波长峰值/峰值功率/平均功率/光斑直径/功率密度/(/)照射频率连续照射与照射物体距离/组别 照射时间/能量密度/(/)表 引物序列 基因引物序列()在 热循环仪(公司)上进行 用于定量 扩增的程序:、的预变性 步扩增包括、(个循环)蛋白印迹分析用 裂解缓冲液(碧云天公司)和 裂解细胞 蛋白测定试剂盒(美伦生物公司)测定裂解物中的蛋白浓度 裂解液与 样品缓冲液在 下孵育 凝胶电泳上样量为每组样本 采用 凝胶电泳系统(凝胶 公司)进行凝胶电泳并转移到 膜上 用含 脱脂乳的 和 ()在室温下封闭 然后用一抗(比例均为 )在 下孵育过夜 室温下用 结合的二抗(公
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