发酵桔皮对酿酒酵母生长性能的影响研究.pdf
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1、试验研究2023年第44卷第21期 总第690期发 酵 桔 皮 对 酿 酒 酵 母 生 长 性 能 的 影 响 研 究 马吉喆1 吴雨来2 张林梅2 叶倩颖2 陆筑凤2 李加友2*徐 涛1(1.浙江理工大学生命科学与医药学院,浙江杭州 310018;2.嘉兴学院生物与化学工程学院,浙江嘉兴 314001)摘 要:研究旨在通过添加新型生长刺激剂促进酵母生长,提升酵母的生长效率。通过向酵母培养基中添加发酵桔皮,探究发酵桔皮对酵母生长的影响,利用单因素试验、正交试验、响应面分析等方法对添加发酵桔皮的酵母培养基进行优化。结果表明:添加发酵桔皮后的优化培养基为:葡萄糖100.756 g/L、蛋白胨8 g
2、/L、酵母浸膏11.906 g/L、发酵桔皮(干物质含量)1.906 g/L、无水硫酸镁2 g/L、尿素2 g/L、磷酸二氢钾5 g/L。培养基优化后酵母生物量达到最大,比未添加发酵桔皮的培养基提高了1.3倍。发酵桔皮可以作为酵母生长刺激剂提高酵母活菌浓度,缩短酵母进入对数生长期的时间,从而促进酵母饲料工业降本增效。关键词:桔皮;发酵;酵母;生长刺激剂;酵母饲料doi:10.13302/ki.fi.2023.21.015中图分类号:S816.6 文献标识码:A 文章编号:1001-991X(2023)21-0094-07Study on Effect of Fermented Orange P
3、eel on Yeast Growth PerformanceMA Jizhe1 WU Yulai2 ZHANG Linmei2 YE Qianying2 LU Zhufeng2 LI Jiayou2*XU Tao1(1.College of Life Science and Medicine,Zhejiang Sci-Tech University,Zhejiang Hangzhou 310018,China;2.School of Biological and Chemical Engineering,Jiaxing University,Zhejiang Jiaxing314001,Ch
4、ina)Abstract:The research aims to promote yeast growth and improve yeast growth efficiency by adding new growth stimulants.By adding fermented orange peel to explore the effect of fermented orange peel on yeast growth in yeast medium.Next,single-factor experiments,orthogonal experiments,response sur
5、face analysis and other methods were used to optimize the yeast medium with fermented orange peel.The results showed that the optimized medium after adding fermented orange peel was:C6H12O6 100.756 g/L,peptone 9 g/L,yeast extract 11.906 g/L,fermented orange peel(dry matter content)1.906 g/L,MgSO4 2
6、g/L,urea 2 g/L,KH2SO4 5 g/L.After medium optimization,yeast biomass was maximized,which was 1.3 times higher than medium without fermented orange peel.Fermented orange peel can be used as yeast growth stimulants to increase yeast live bacteria concentration,shorten the time for yeast to enter the lo
7、garithmic growth period,thereby reducing costs and increasing efficiency for yeast feed industry.Key words:orange peel;ferment;yeast;growth stimulants;yeast feed随着生物工程技术、畜牧业和饲料工业的发展以及中国居民对高蛋白类食品需求量的增加1,酵母类产品的开发利用已成为饲料工业的重中之重。中国饲料工业协会明确指出:我国的高蛋白饲料在配方结构、产品创新中更加趋向于酵母培养物类的饲料添加剂2-3。酵母饲料是利用酵母的新陈代谢,通过微生物发酵
8、技术制成含有活菌、适口性良好、安全、无污染、无残留的酵母培养物4-5。研究报道酵母饲料6-7不仅具有原料来源广泛、生产速度快、蛋白质含量高的优点,而且可以调节动物肠道微生物菌群结构、提高饲料利用率、增强动物机体免疫力8-12,在畜牧养殖业生产中具有广阔的应用前景。但酵母存在的培养产量低、效率差等问题,使得酵母铬、酵母葡聚糖、生作者简介:马吉喆,硕士,研究方向为发酵技术。*通讯作者:李加友,教授。收稿日期:2023-08-11基金项目:浙江省自然科学基金公益项目LGN22C200009;嘉兴市科技计划项目2021AD1001094SILIAO GONGYE2023年第44卷第21期 总第690期
9、物多肽等相关酵母饲料成本过高13-15。研究表明,提高酵母的生长性能主要采用添加辅助因子16和培养基优化改良17等方法。其中,通过添加海藻糖等辅助因子可以增强酵母免疫力,使酵母具有高生物活性,但价格昂贵不便于投入到工业生产应用中。因此有必要进一步研究酵母菌在发酵过程中营养成分之间的相互作用,通过添加发酵桔皮和酵母培养基优化相结合,观测酵母的生长趋势变化,从而在酵母饲料工业中做到降本增效、改善生产工艺、提高产品的市场竞争力。1 材料与仪器1.1 试验材料桔皮,宁波市象山华宇罐头厂;葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)1118,嘉兴学院发酵食品开发与分析检测实验室保藏菌种;酿酒酵母(
10、Saccharomyces cerevisiae),安琪酵母股份有限公司;葡萄糖(食品级),浙江一诺生物科技有限公司;酵母浸膏,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;尿素(纯度99.5%)、无水硫酸镁(纯度99.5%)、磷酸二氢钾(纯度99%)、蛋白胨,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。初始发酵培养基(g/L):葡萄糖100、酵母浸膏10、尿素2、无水硫酸镁2、磷酸二氢钾5。1.2 仪器与设备ZHWY-200B型全温摇床,上海智城分析仪器制造有限公司产品;CT14RD11台式离心机,上海天美生化仪器设备有限公司产品;FR124CN型分析天平,奥豪斯仪器有限公司产品;紫外分光光度计,上海美谱达仪器有限公
11、司产品。2 试验方法2.1 发酵桔皮的制备称取适量干燥桔皮,研磨过筛(10目筛网)置于发酵桶中,加入桔皮粉干重1.5倍质量的水,混合均匀,用直径1 cm打孔器从匍枝根霉1118的PDA固体培养基上取2个菌苔,加入培养基中,使菌种与桔皮粉充分接触。于28 恒温培养15 d。对发酵物进行过滤除渣,制成浸膏状水溶性发酵桔皮(干物质含量21%),4 下冷藏保存,备用。2.2 酵母培养菌种活化:将1 g酿酒酵母活性干酵母加入100 mL葡萄糖含量为2%的培养基中,38、220 r/min摇床振荡培养30 min,对菌种进行活化,制得种子菌液。酿酒酵母发酵培养:取 1 mL 种子菌液接种至100 mL发酵
12、培养基中,28 恒温培养。2.3 酵母浓度测定2.3.1 标准曲线绘制取酵母发酵培养基中1 mL的样液于显微镜下计数,将样液分别梯度稀释10、20、30、40、50倍,并测定OD600,绘制OD600与对应酵母活菌数的标准曲线。2.3.2 检测方法参照参考文献18,采用吸光光度法对发酵液的生物量进行测定。并将发酵液进行梯度稀释至1/20,利用分光光度计于600 nm处测定吸光度,结果记为OD600,并以此读数作为培养基中的酵母浓度。2.4 培养基优化试验2.4.1 单因素试验以酿酒酵母初始发酵培养基为基础,分别考察发酵桔皮、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏等不同添加量对酿酒酵母生长的影响,每次处理只改变
13、初始发酵培养基的一个因子。按1%(W/V)接入活化酿酒酵母,28 下恒温培养24 h检测OD600,确定各单因素的最佳水平。2.4.2 正交试验在单因素试验的基础上,以发酵桔皮(A)、葡萄糖(B)、蛋白胨(C)及酵母浸膏(D)为考察对象,采用L8(2)7正交试验设计,对酿酒酵母发酵培养基进一步优化。各因素与水平见表1。表1 正交试验因素水平(g/L)水平12A1.82.2B90110AB12C79AC12BC12D11132.4.3 Box-Benhnken响应面分析在正交试验基础上,采用 Box-Benhnken 设计结合响应面分析对发酵桔皮(E)、葡萄糖(F)、酵母浸膏(G)等三个主要影响
14、因子进行优化。各因素 Box-Benhnken设计方法与水平见表2。表2 响应面分析各因素与水平(g/L)水平-101E1.522.5F90100110G1112132.4.4 桔皮发酵物成分检测用常规方法检测桔皮发酵物中橙皮苷19、黄酮20等药效成分含量以及多糖21、蛋白质22、脂肪23等营养成分。95试验研究2023年第44卷第21期 总第690期2.5 数据处理每组试验进行 5 次平行测定,借助 Minitab 16、Design-Expert 13.0和Origin 2021对数据进行统计分析。P0.05为差异不显著,0.05P葡萄糖(B)葡萄糖与发酵桔皮的交互作用AB酵母浸膏(D)蛋
15、白胨(C);另一方面,葡萄糖和发酵桔皮具有交互作用,可能是发酵桔皮有利于促进葡萄糖的代谢,具体机理有待深入研究。从表4可以看出,培养基各因子的最优组合为A2B2C2D1。但蛋白胨浓度的影响水平只有0.02,相对较小,因此进行单因素最佳水平的响应面分析试验时不作为主要考虑因素。理论最优培养基为(g/L):葡萄糖110、蛋白胨9、酵母浸膏11、发酵桔皮2.2、无水硫酸镁2、尿素2、磷酸二氢钾5。3.4 Box-Benhnken响应面结果及分析3.4.1 Box-Benhnken响应面优化试验及结果分析设 OD600读数(Z)为响应值,采用 Box-Benhnken响应面优化设计原理,考察发酵桔皮(
16、E)、葡萄糖(F)、酵母浸膏(G)三个因素对 OD600读数(Z)的影响。OD600读数响应面试验设计及结果见表5。由表5可以看出,不同添加量的E、F、G对OD600读数(Z)的影响各不相同。表4 正交试验结果编号12345678K1K2R因素A111122220.6430.6730.030B112211220.6470.6690.022AB112222110.6630.6540.009C121212120.6570.6590.002AC12122121BC12211221D122112210.6610.6550.006OD6000.6360.6380.6570.6420.6620.6530.
17、6730.704注:K1代表“1”水平下试验数据平均值;K2代表“2”水平下试验数据平均值。表5 Box-Benhnken响应面优化试验及结果分析编号1234567891011121314151617E-11-11-11-11000000000F-1-1110000-11-1100000G0000-1-111-1-11100000Z0.6270.6240.6530.6110.6610.6190.6360.6270.6270.6420.6190.6270.7110.7030.7030.7090.7113.4.2 OD600读数响应面优化试验回归模型及方差分析将OD600读数(Z)响应面结果进行二
18、次响应面回归分析,结果见表6。97试验研究2023年第44卷第21期 总第690期表6 各因素影响的主效应分析组分模型E-发酵桔皮浓度F-葡萄糖浓度G-酵母膏浓度EFEGFGEFG残差失拟项纯误差总计决定系数R2可调节系数R2预测系数R2准确性平方和0.022 90.001 20.000 20.000 20.000 40.000 30.000 00.005 40.007 70.054 00.000 10.000 10.000 10.023 00.996 10.991 20.980 435.126 1自由度911111111173416方差0.002 50.001 20.000 20.000 2
19、0.000 40.000 30.000 00.005 40.007 70.054 00.000 17.1610-60F值200.590.9112.7815.7830.0121.490.966 7426.46609.40426.460.426 6P值0.000 10.000 10.009 00.005 40.000 90.002 40.358 20.000 10.000 14,表示该单因素响应面模型信号充足,可以用于模型预测设计。其决定系数R2为0.996 1,表明99.61%以上的响应值均可由该模型解释。因此可用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。通过Design-Expert 13软
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