二穗短柄草SPL家族基因的鉴定、系统发育和表达分析.pdf
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1、麦类作物学报 2 0 2 3,4 3(1 1):1 3 7 2-1 3 8 3J o u r n a l o fT r i t i c e a eC r o p sd o i:1 0.7 6 0 6/j.i s s n.1 0 0 9-1 0 4 1.2 0 2 3.1 1.0 2网络出版时间:2 0 2 3-0 9-1 9网络出版地址:h t t p s:/l i n k.c n k i.n e t/u r l i d/6 1.1 3 5 9.S.2 0 2 3 0 9 1 8.1 2 5 1.0 0 6二穗短柄草S P L家族基因的鉴定、系统发育和表达分析收稿日期:2 0 2 2-1 2-
2、0 7 修回日期:2 0 2 3-0 3-1 7第一作者E-m a i l:s h u t i n g w a n g n w a f u.e d u.c n通讯作者:马翎健(E-m a i l:m a l i n g j i a n n w a f u.e d u.c n)王淑婷1,朱 婷1,马浩森1,李小鹏2,牛 娜1,马翎健1(1.西北农林科技大学农学院,陕西杨凌7 1 2 1 0 0;2.渭南市农资农产品质量检测中心,陕西渭南7 1 4 0 0 0)摘 要:植物特异性S P L家族基因编码S B P(s q u a m o s ap r o m o t e r-b i n d i n
3、gp r o t e i n-l i k e)保守结构,参与调节植物的生长和发育。为了解二穗短柄草中S P L家族基因的分布、结构及功能,对二穗短柄草全基因组中S P L家族成员进行了系统分析。结果表明,在二穗短柄草全基因组中鉴定出1 7个B d S P L基因,在5条染色体上呈不均匀分布,b d 0 3号染色体上分布最多;根据系统发育树,1 7个B d S P L被分为6个组,同组成员有保守的结构和基序;其中6对B d S P L基因发生基因复制事件;在B d S P L基因启动子区域发现了各种顺式元件,如A B R E、C G T A C-m o t i f和L T R。转录组数据和q R
4、 T-P C R分析显示,B d S P L基因在二穗短柄草花中表达量较高,而在根系中表达量较低,在不同植物激素处理下表达量有差异。关键词:二穗短柄草;S P L基因家族;系统进化;表达分析中图分类号:S 5 1 9;S 3 3 0 文献标识码:A 文章编号:1 0 0 9-1 0 4 1(2 0 2 3)1 1-1 3 7 2-1 2I d e n t i f i c a t i o n,P h y l o g e n ya n dE x p r e s s i o nA n a l y s i so f t h eS P LG e n eF a m i l y i nB.d i s t a
5、 c h y o n.WA N GS h u t i n g1,Z H UT i n g1,MAH a o s e n1,L IX i a o p e n g2,N I UN a1,MAL i n g j i a n1(1.C o l l e g eo fA g r o n o m y,N o r t h w e s tA&FU n i v e r s i t y,Y a n g l i n g,S h a a n x i 7 1 2 1 0 0,C h i n a;2.W e i n a nA g r i c u l t u r a lP r o d u c t sQ u a l i t y
6、T e s t i n gC e n t e r,W e i n a n,S h a a n x i 7 1 4 0 0 0,C h i n a)A b s t r a c t:T h ep l a n t-s p e c i f i cS P Lf a m i l y(s q u a m o s ap r o m o t e r-b i n d i n gp r o t e i n-l i k e)g e n ee n c o d e st h eS B Pc o n s e r v e dd o m a i nt h a t i s i n v o l v e d i nt h e r e
7、 g u l a t i o no fp l a n tg r o w t ha n dd e v e l o p m e n t.T ou n d e r-s t a n dt h ed i s t r i b u t i o n,s t r u c t u r ea n d f u n c t i o no fS P Lg e n e s i nB r a c h y p o d i u md i s t a c h y o n,t h eS P Lg e n ef a m i l yw a s a n a l y z e ds y s t e m a t i c a l l y i nt
8、 h e w h o l eg e n o m e i nt h i s s t u d y.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t 1 7B d-S P Lg e n e sw e r e i d e n t i f i e d i n t h ew h o l eg e n o m eo fB r a c h y p o d i u m d i s t a c h y o n.A c c o r d i n g t o t h ep h y l o g e-n e t i c t r e e,t h e1 7B d S P Lg e n e sw e
9、 r ed i v i d e d i n t os i xg r o u p s,a n dm e m b e r so f t h es a m e f a m i l ys h a r e dt h ec o n s e r v e dg e n es t r u c t u r e sa n d m o t i f s.G e n ed u p l i c a t i o ne v e n t so c c u r r e di n6p a i r so fB d S P Lg e n e s.P r o m o t e ra n a l y s i ss h o w e dt h a
10、 t t h e r ew e r ev a r i o u sc i s-e l e m e n t s,s u c ha sA B R E,C G T A C-m o-t i f,a n dL T R.T r a n s c r i p t o m ea n dq R T-P C Ra n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h ee x p r e s s i o nl e v e lo fS P Lg e n ew a sh i g h e r i nf l o w e r s,b u t l o w e r i nr o o t s,a n dd i
11、 f f e r e n t e x p r e s s i o np a t t e r n sw e r eo b s e r v e du n d e rd i f-f e r e n tp l a n th o r m o n e t r e a t m e n t s.K e y w o r d s:B r a c h y p o d i u md i s t a c h y o n;S P Lg e n e f a m i l y;P h y l o g e n y;E x p r e s s i o np a t t e r n s 基因家族由结构和功能相似的多个基因组成,在特定
12、的生物体中扮演着重要的角色。目前,在真核 生 物 中 已 经 发 现 了 各 种 基 因 家 族,如b HLH1、T C P2和P r x3等。S P L家 族 基 因(Am S B P 1和Am S B P 2)在金鱼草的花分生组织中首次被发现,后在多种植物中被鉴定出。S P L蛋白均含有一个高度保守结构域(也称为S B P结构域),由两个独立的锌指结构组成,其中包含Z n-1(C y s 3 H i s或C y s 4)和Z n-2(C y s 2 H i s C y s)6-7;每个锌指位点由4个氨基酸残基结合一个锌离子,在维持蛋白质构象稳定方面发挥重要作用8。在S B P结构域的C末端
13、,有一个保守的核定位信号重叠在第二个锌指结构上,将S B P蛋白引导到细胞核中,调节下游基因的转录9。目前,S P L家族基因已经在拟南芥1 0-1 1、水稻7、大 豆1 2、矮 牵 牛1 3、棉 花1 4、烟 草1 5、泡桐1 6、藜麦1 7和水曲柳1 8中得到研究。但还没有关于二穗短柄草S P L家族基因的报道。研究表明,S P L家族基因由m i R 1 5 6/1 5 7调控,在 植 物 生 长 和 生 理 的 各 个 方 面 发 挥 着 作用1 1,1 9-2 0;在拟南芥1 7个S P Ls中,有1 1个含有m i R 1 5 6/1 5 7识别位点2 3-2 4。S c h w
14、a b等2 5发现,拟南芥中过表达m i R 1 5 6使多个S P L s的表达下调,这些S P L s都含有m i R 1 5 6/1 5 7识别位点,而其他没有该识别位点的S P L s不受影响;突变5个A t S P L 3的m i R 1 5 6/1 5 7识 别 位 点 碱 基 后,A t-S P L 3的转录水平显著提高。在番茄中,大部分S P L基 因 在 茎 尖、花 序 和 果 实 中 高 表 达,而m i R 1 5 6/1 5 7在这三个组织中的表达较低,表明m i R 1 5 6/1 5 7与S P L s的表达水平呈负相关。S P L基因参与植物的信号转导,如A t
15、S P L 8可抑制促进种子 萌 发 和 根 生 长 的 下 游 基 因 的 表 达2 7;V v S B P 3和V v S B P 5参与葡萄的低温反应2 8。二穗短柄草基因组较小,与粮食作物如小麦、大麦和水稻关系密切2 9。目前,关于拟南芥和水稻S P L家族基因的功能研究较多,但其在二穗短柄草中的信息还不清楚。本研究拟对二穗短柄草中的S P L家族基因进行鉴定,分析其基因结构、基序、顺式元件、系统发育、基因复制、GO注释和表达模式等,并对其功能进行预测,为粮食作物功能基因的发现与利用提供参考。1 材料和方法1.1 二穗短柄草中S P L基因的鉴定从E n s e m b l p l a
16、 n t数据库(h t t p:/p l a n t s.e n-s e m b l.o r g/)下载二穗短柄草的全基因组数据,包括基因组序列文件和蛋白序列文件。从P F AM数据库(h t t p:/p f a m.x f a m.o r g/)下载S B P结构域(P F 0 3 1 1 0);使用HMME R3.0程序将S B P结构域作为查询序列,在二穗短柄草中寻找包含S B P结构域的蛋白质;以水稻和拟南芥的S B P蛋白序列为查询序列,利用B L A S T P程序对二穗短柄草蛋白序列进行检索。分析HMM和B L A S T P的结果,鉴定出B d S P L蛋白。利用N C B
17、 I-C D D网络服务器(h t t p s:/w w w.n c b i.n l m.n i h.g o v/S t r u c-t u r e/b w r p s b/b w r p s b.c g i)和P F AM数据库对候选的B d S P L蛋白进行鉴定。共得到1 7个B d S P L蛋白,其 相 应 基 因 依 次 命 名 为B d S P L 1B d-S P L 1 7。从E x P A S Y服 务 器(h t t p s:/w e b.e x-p a s y.o r g/c o m p u t e_p i/)3 0获得B d S P L蛋白质的理论等电点(P I)和相
18、对分子质量(MW),并使用C e l l oW e b服务器(h t t p:/c e l l o.l i f e.n c t u.e d u.t w/)预测这些蛋白质的细胞定位。1.2 B d S P L蛋白的系统发育分析使用C l u a s t X2.0软件3 1对二穗短柄草、水稻和拟南芥的S P L蛋白氨基酸序列进行比对,利用M E G A8.0软件的邻接法(N e i g h b o r-J o i n i n g)构建系统发育树,b o o t s t r a p参数设置为10 0 03 2。1.3 B d S P L基因的结构及保守基序分析利 用G e n eS t r u c
19、t u r e D i s p l a y S e r v e r(h t-t p:/g s d s.g a o-l a b.o r g/)对其基因结构和编码序列(C D S)进行分析3 3。利用MEMEv 4.9.0(h t-t p:/m e m e-s u i t e.o r g/t o o l s/m e m e)分 析B d-S P L蛋白的保守基序,基序最佳氨基酸数1 02 5 0,最大基序数量设置为1 5个3 4。1.4 二穗短柄草、水稻、小麦和玉米的S P Ls共线性分析利用M C S c a n X3 5软件检测二穗短柄草与水稻、玉米、小麦之间的S P L区域。使用C i r
20、c o s0.6 7比较B d S P L与上述物种之间的共线性关系3 6。比较 共 线 基 因 对 的C D S和 蛋 白 质 序 列,使 用KAK S_C a l c u l a t o r软件计算KAK S比率3 7。用W a n g3的方法计算共线基因对的发散时间(T)。1.5 S P L的G O注释及其与其他蛋白质相互作用分析二穗短 柄 草 中S P L蛋 白 的GO注 释 来 自P L A Z A数 据 库(h t t p s:/b i o i n f o r m a t i c s.p s b.u g e n t.b e/p l a z a/v e r s i o n s/p l
21、 a z a_v 5_d i c o t s/)3 8和P l a n tT r a n s c r i p t i o n a lR e g u l a t o r y M a p数 据 库(h t t p:/p l a n t r e g m a p.g a o-l a b.o r g/)。使用A r e-n a n N e tV 23 9和C y t o s c a p e软件4 0构建B d S P L与其他二穗短柄草蛋白之间的相互作用网络。1.6 B d S P L s的启动子分析从E n s e m b l p l a n t数据库下载B d S P L基因上3731第1 1期王淑
22、婷等:二穗短柄草S P L家族基因的鉴定、系统发育和表达分析游1.5k b的D N A序列,提交到P L A C E数据库(h t-t p:/b i o i n f o r m a t i c s.p s b.u g e n t.b e/w e b t o o l s/p l a n t-c a r e/h t m l/),预测启动子区域的顺式调控元件4 1。1.7 B d S P L s的基因表达分析从S R A数据库(h t t p s:/www.n c b i.n l m.n i h.g o v/s r a)中获得1 7个B d S P L基因在九种组织4 2和不同植物激素处理下4 3的
23、数据,分析其表达模式。将二穗短柄草B d 2 1的种子铺在有滤纸的培养皿中,使水轻微没过种子,发芽35d。将泥炭土、蛭石、营养土按照1 1 1的比例充分混匀,装到培养盆(1 0c m1 0c m8.5c m)中。挑选长势一致且健壮的二穗短柄草幼苗移栽至培养盆中,每个培养盆3株,于1 6/8h昼夜光周期、2 3、相对湿度5 5%6 0%的温室培养;35d浇水并施肥一次,在抽穗期采集根、叶、茎和花序进行S P L基因表达分析。同上述方法将二穗短柄草在铺有滤纸的培养皿培养至3周龄,分别用2 0 0mm o lL-1N a C l、1 0 0m o lL-1GA、1 0 0m o lL-1A B A和
24、2 0%P E G 6 0 0处理液没过幼苗根部,并用相应处理液喷湿茎和叶;同时设低温(-4)处理4 4,均保持2h后用流水冲洗幼苗;将所有样品用液氮速冻,于-8 0保存备用。使用 艾 科 瑞 公 司 的R NA提 取 试 剂 盒(AG 2 1 0 1 9)提取上述材料的总R NA;使用E v oM-ML V R T-P C R试剂盒(A c c u r a t eB i o l o g y,中国湖南)合成c D NA,使用P r i m e r P r e m i e r5.0软件设计1 7个B d S P L基因的q R T-P C R特异性引物(表1)。使用艾科瑞公司的P r oT a
25、qH S预混型q P C R试剂盒(含R O X)(AG 1 1 7 1 8)参照说明书用Q u a n t S t u d i oTMR e a lT i m eP C R仪进行实时定量P C R。B d U B C 1 8为参考基因,相对表达量通过2-CT方法计算。2 结果2.1 二穗短柄草S P L家族基因的鉴定和染色体定位所得1 7个编码S B P蛋白的基因(表2)。在二穗短柄草的5条染色体上分布不均,其中6个分布在第3染色体上,占3 5%,第1、2、4染色体上均有3个,有2个位于第5染色体上。表1 q R T-P C R所用引物T a b l e1 P r i m e r su s
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