非肝硬化乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的转录组测序及其对患者生存的影响.pdf
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1、2023 年10 月 第 44 卷 第 5 期 首 都 医 科 大 学 学 报Journal of Capital Medical University Oct.2023Vol.44 No.5基金项目:北京市百千万人才工程资助项目(2019A15),北京市属医学科研院所公益发展改革试点项目(京医研 2021-10)。This study was supported by Beijing Hundred Thousand Talents Project(2019A15),the Beijing Municipal Institute of Public Medical Research Deve
2、lopment and Reform Pilot Project(2021-10).Corresponding author,E-mail:wujiancupes 网络出版时间:2023-10-20 1010 网络出版地址:https:/ 妍1 刘 芳2 郭 闪2 吴 剑1(1.首都体育学院运动科学与健康学院,北京 100191;2.首都医科大学附属北京佑安医院北京肝病研究所,北京 100069)【摘要】目的 通过转录组测序以及生物信息学分析探讨非肝硬化乙型肝炎病毒(hepatitis B viral,HBV)相关肝细胞癌的转录特征及与患者生存的关系。方法 通过转录组测序获得非肝硬化 HBV
3、相关肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的差异表达基因;利用基因本体(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)数据库富集分析获得差异表达基因涉及的生物功能过程及信号通路;通过基因-基因功能相互作用网络分析获得关键基因;利用癌症基因图谱(the cancer genome atlas,TCGA)数据库肝癌队列对关键基因进行生存预后分析。结果 共发现上调差异基因3 672 个,下调差异基因 2 715 个。GO 功能富集分析主要涉及细胞分化、DNA 复制、
4、DNA 修复、炎症反应免疫应答、细胞黏附等。KEGG 通路富集主要包括细胞周期、氧化磷酸化、p53 信号通路、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)信号通路和核因子 B(nuclear factor kappa-B,NF-B)信号通路等。其中丝裂原活化蛋白激酶 3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)、Ras 相关 C3 肉毒毒素底物 1(ras-related C3 cotulinum toxin substrate 1,RAC1)、磷脂酶 C1(phospholipase C beta 1,PLC1)、连环蛋白 1(
5、catenin beta 1,CTNN1)、非转移性细胞 1(non-metastatic cells 1,NME1)基因和非转移性细胞 6(non-metastatic cells 6,NME6)基因高表达与肝癌患者预后不良相关(P0.05);FYN、细胞色素 P450(cytochrome P450,CYP)2C8 和 CYP2C9 低表达与肝癌患者预后不良有关(P0.05)。结论 非肝硬化 HBV 相关肝细胞癌发生涉及多个生物学过程和信号通路的改变,与肝癌患者的生存预后相关的关键基因为理解非肝硬化 HBV 相关 HCC 发生机制提供新线索。【关键词】非肝硬化肝细胞癌;差异表达基因;信号通
6、路【中图分类号】R73 【文献标识码】ATranscriptome sequencing and survival analysis of noncirrhotic hepatitis B viral(HBV)-related hepatocellular carcinomaWan Yan1,Liu Fang2,Guo Shan2,Wu Jian1(1.School of Kinesiology and Health,Capital University of Physical Education and Sports,Beijing 100191,China;2.Beijing Instit
7、ute of Hepatology,Beijing Youan Hospital,Capital Medical University,Beijing 100069,China)【Abstract】Objective Transcriptome sequencing and bioinformatics analysis were used to explore the transcriptional characteristics and survival analysis of non-cirrhotic hepatitis B viral(HBV)-related hepatocellu
8、lar carcinoma(HCC).Methods The differentially expressed genes in non-cirrhotic HBV-related HCC were obtained by transcriptome sequencing.The biological functional processes and signaling pathways involved in the differentially expressed genes were obtained by gene ontology(GO)and Kyoto Encyclopedia
9、of Genes and Genomes(KEGG)enrichment analysis.The key genes were obtained by gene-gene function interaction network analysis,and the key genes were analyzed for survival prognosis using the cancer genome atlas(TCGA)databases HCC cohort.ResultsA total of 3 672 up-regulated differential genes and 2 71
10、5 down-regulated differential genes were identified.The GO functional enrichment analysis mainly involved cell differentiation,DNA replication,DNA repair,inflammation response,immune response,cell adhesion,etc,while the KEGG pathway enrichment mainly included cell cycle,oxidative phosphorylation,p53
11、 signaling pathway,tumor necrosis factor(TNF)signaling pathway,and nuclear factor kappa-B(NF-B)signaling pathway.Among them,high expression of mitogen-activated protein kinase 3(MAPK3),ras-related C3 cotulinum toxin substrate 1(RAC1),phospholipase C beta 1(PLC1),catenin beta 1(CTNN1),non-metastatic
12、cells 1(NME1),and non-metastatic cells 6(NME6)was associated with poor prognosis in HCC patients(P0.05),while low expression of FYN,首 都 医 科 大 学 学 报第 44 卷cytochrome P450 2C8(CYP2C8),and cytochrome P450 2C9(CYP2C9)was associated with poor prognosis in HCC patients(P0.05).Conclusions Non-cirrhotic HBV-
13、related HCC involves multiple biological processes and alterations in signaling pathways,and the key genes related to the survival and prognosis of HCC patients provide new clues for understanding the mechanism of HBV-related HCC in non-cirrhosis patients.【Key words】non-cirrhotic hepatocellular carc
14、inoma;differentially expressed genes;signalling pathways 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是成人中最常见的原发性肝癌。HCC 通常发生在肝硬化基础之上,常见的促进肝硬化形成的炎症诱导危险因素包括:慢性肝炎感染,如乙型肝炎病毒(hepatitis B vi-ral,HBV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C viral,HCV)、酗酒和非酒精性脂肪性肝病1。然而,约 20%的 HCC发生在非肝硬化的肝脏上,非肝硬化肝癌指不是在肝硬化基础上发生的肝癌2。与肝硬化来源 HCC 相比,如果尽早诊断,非肝硬化
15、 HCC 患者可有效地进行肿瘤切除,保持足够的肝功能,预后良好;然而非肝硬化HCC 的晚期诊断通常表现为更大、更具侵袭性的肿瘤,容易发生转移3。非肝硬化 HCC 在基因组上与肝硬化 HCC 相似,然而发生机制仍不明确4。HBV 感染引起的肝硬化是我国 HCC 最为重要的危险因素,因此本研究通过转录组测序方法分析非肝硬化 HBV 相关 HCC 的转录特征及关键基因与信号通路变化,为理解非肝硬化 HBV 相关 HCC 发生机制提供新线索,为探索新的治疗靶点提供数据支持。1 材料与方法1.1 组织来源 本实验所用的癌及癌旁(距离肿瘤边界 2 cm 以外)组织来自 7 例临床非肝硬化 HBV 相关 H
16、CC 患者,患者均为男性,平均年龄(61.49.8)岁。标本获取后立即分装,液氮速冻后,保存于-80 。患者均知情同意。该研究方案已获得首都医科大学附属北京佑安医院个人伦理审查委员会的批准,批号:京佑科伦字2021086 号。1.2 实验室检测方法 高通量测序:由北京贝瑞和康生物技术有限公司完成。简述如下:利用 zymoBIOMICS RNA Miniprep Kit(R2001,Zymo 公司,美国)从 20 mg 组织样品中提取总 RNA,质检合格后,通过 VAHTS Universal V6 RNA-seq Library Prep Kit for Illumina(NR604-01,诺
17、唯赞,中国)进行建库,带有 Oligo(dT)的磁珠与 ployA 进行 A-T 碱基配对,可以从总 RNA 中分离出 mRNA,用于分析转录组信息。最后基于 Illumina No-vaseq 6000(Illumina 公司,美国)测序平台进行测序,每个样品数据量为 10 G。生物信息分析:首先对原始下机数据进行质控,质控后合格的数据即 Clean data(reads),应用软件TopHat2 与参考基因组进行比对,获得有效 reads 用于后续分析。通过对测序基因进行定量分析,获得基因的 Read Counts 后,利用 DESeq2 软件对 2 组样本进行样本间基因的表达差异分析,鉴
18、定出样本间差异表达的基因。对获得的差异表达基因,进行基因本体(gene ontology,GO)、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)功能注释及功能富集研究,通过功能富集分析,获得该基因集中的基因主要功能或主要参与的代谢通路。通过 STRING 互作数据库中的互作关系进行基因-基因功能相互作用网络分析,使用 Cytoscape 构建目标基因群中基因与基因产物间的信号传递网络,获得基因间的相互作用关系及网络的核心调节基因,反映全局层面的基因调节机制。1.3 生存预后分析 通过 UALCAN 在线数据库(https:/
19、ualcan.path.uab.edu/index.html)选择基于癌症基因图谱(the cancer genome atlas,TCGA)数据库中的肝细胞癌队列(liver hepatocellular carcinoma,LIHC),对筛选出来的差异基因进行生存分析,获得基因表达水平与肝细胞癌患者预后的关系。2 结果2.1 研究人群的基线特征7 例 HCC 患者中 6 例乙型肝炎病毒表面抗原、e抗体、核心抗体均为阳性,1 例经治疗后抗原、抗体均转阴。丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)中位数 60.00(26.0088.50)U/L,门冬氨酸氨基转
20、移酶(aspartate aminotransferase,AST)中位数41.00(22.50 62.00)U/L。总蛋白均值(69.57 11.11)g/L,白蛋白均值(41.065.38)g/L。甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)中 位 数 5.63(2.16 13.23)ng/mL。肿瘤直径 30 97 mm,平均 49.33 218第 5 期万 妍等:非肝硬化乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的转录组测序及其对患者生存的影响mm,随 访 存 活 率 28.57%,详 见 表 1。随 访 存 活率 28.57%。2.2 差异表达基因筛选将非肝硬化 HBV 相关 HCC 癌组织
21、和对应癌旁组织进行转录组测序,对差异表达基因的 mRNA 表达水平进行聚类分析(图 1),肿瘤组织与癌旁组织被较好地聚集为两簇。筛选 P adjust2 的基因为差异基因,共获得 6 387 个差异基因:其中上调基因 3 672 个,下调基因 2 715 个。2.3 差异基因的 GO 功能富集分析将上下调基因分别进行 GO 功能富集分析,研究其所参与的生物功能过程。与癌旁组织相比,非肝硬化 HBV 相关 HCC 肿瘤组织 GO 富集程度主要包括:上调基因涉及细胞分化、有丝核分裂、DNA 复制、DNA 修复等(图 2A),下调基因涉及炎症反应、细胞表面受体信号通路、免疫应答、细胞黏附等(图2B)
22、。2.4 差异基因的 KEGG 通路富集分析将上下调基因分别进行 KEGG 通路富集分析。上调基因代表性富集途径包括 DNA 复制、细胞周期、氧化磷酸化、p53 信号通路、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢等(图 3A);下调基因主要富集途径包括 T 细胞受体信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、B 细胞受体信号通路、自然杀伤细胞调控的细胞毒性、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)信号通路和核因子 B(nuclear factor kappa-B,NF-B)信号通路等(图 3B)。2.5 差异表达基因互作网络分析将非肝硬化 HBV 相关肝癌患者差异表达 mRNA进行基因-
23、基因功能相互作用网络分析(图 4)。互作网络图中节点(Node)代表基因,Node 的大小与此节点的度(Degree)成正比,即与此节点相连的边越多,它的度越大,节点也就越大,这些节点在网络中可能处于较为核心的位置。红色代表上调基因,蓝色代表下调基因。Line 代表两基因之间存在关系。根据相互作用得分获得相互作用网络的中心节点关键基因,根据 Degree20,共筛选出 19 个上调关键差异基因(表 2),和 21 个下调关键差异基因(表 3)。表 1 研究人群的基线特征Tab.1 Baseline characteristics of the study population Gender A
24、ge/a HBsAganti-HBs/(IU L-1)HBeAg Anti-HBe Anti-HBcALT/(U L-1)AST/(U L-1)TP/(g L-1)ALB/(g L-1)AFP/(ng mL-1)Tumor size/mmSurgical approachFollow-upMale612 728(+)2(-)0.1(-)0.005(+)0.009(+)372868.443.92.7554Hemihepatectomy under general an-esthesiaDeathMale6448.54(+)268.5(+)0.179(-)0.111(+)0.007(+)15177
25、4.145.67.2835Laparoscopic hep-atectomy for liver cancer under gen-eral anesthesiaSurvivalMale647 397(+)6.88(-)0.115(-)0.003(+)0.009(+)152574.246.31.65-Liver transplanta-tionDeathMale497 421(+)2(-)0.088(-)0.003(+)0.007(+)604768.437.55.6397Liver tumor resec-tion surgery under general anesthesiaDeathMa
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