银屑病发病分子机制研究.doc
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1、 国家自然科学基金申请书申请代码:受理部门: 收件日期:受理编号:第 28 页 版本1.006.023国家自然科学基金申 请 书您现在不能检查保护文档或打印文档,请根据以下三个步骤操作: 1)如果您是Word2000或以上版本用户,请把Word宏的安全性设为:中 方法: Word菜单-工具-宏-安全性-安全级,设置为中 (如果您是Word97用户,继续执行以下步骤) 2)关闭本文档,重新打开本文档 3)点击启用宏按钮,即可开始填写本文档或打印了资助类别: 亚类说明: 附注说明: 项目名称: 申 请 者: 电话: 依托单位: 通讯地址: 邮政编码: 单位电话: 电子邮件: 申报日期: 200年月
2、日国家自然科学基金委员会基本信息0UQpCL0k申 请 者 信 息姓名性别 出生年月 年 月民族 学位 职称 主要研究领域 电话 电子邮件 传真 个人网页 工作单位 在研项目批准号 依托单位信息名称代 码 联系人 电子邮件 电话 网站地址 合作单位信息单 位 名 称代 码 项 目 基 本 信 息项目名称资助类别面上项目 亚类说明自由申请项目 附注说明 申请代码C030116:皮肤病学C030115:性传播疾病学基地类别 预计研究年限2006年1月 2008年12月研究属性应用基础研究 摘 要项目研究内容和意义简介(限400字):真皮内T细胞异常活化、角质形成细胞(KC)增殖和分化异常和中性粒细
3、胞异常趋化是银屑病的重要特点。CD147是一种新型跨膜糖蛋白,我们曾率先证实其与KC分化状态密切相关。CD147与T细胞增殖、活化和聚集有关;并可以作为细胞膜受体参与亲环素(CyP)A和B介导的T细胞基质黏附和中性粒细胞趋化。本研究中,我们将首先了解CD147、CyPA和CyPB在Jurkat T细胞,银屑病外周血炎症细胞和皮损中的表达;再通过CD147 siRNA转染明确其在T细胞增殖、活化及基质黏附中的作用,和在CyPA和CyPB介导的中性粒细胞趋化中的作用;最后建立人银屑病皮损-SCID鼠移植模型,在皮损内局部注射转染细胞以明确CD147 siRNA能否在体内缓解银屑病皮损发展。从而明确
4、CD147在银屑病诸多发病环节中的作用和机制,明确CD147 siRNA对移植皮损的效应,为探寻银屑病新的治疗方法提供新的靶分子。关 键 词(用分号分开,最多5个)CD147;银屑病;亲环素;siRNA;SCID鼠 项目组主要成员(国家杰出青年科学基金不填此栏)编号姓 名出生年月性别职 称学 位单位名称电话电子邮件项目分工每年工作时间(月)1 2 3 4 5 6 7 89总人数高级中级初级博士后博士生硕士生822112说明: 1. 高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报,总人数自动生成。说明: 2. 项目组主要成员不包括项目申请者。经费申请表 (金额单位:万元)科目申请
5、经费备注(计算依据与说明)一.研究经费22.45001.科研业务费3.0000(1)测试/计算/分析费0.8000图像分析、测序、酶联免疫检测等(2)能源/动力费0.2000实验期间所消耗水电的消耗(3)会议费/差旅费1.0000国内及国际学术会议各1次(4)出版物/文献/信息传播费1.0000资料印刷、复印、版面费、计算机和网络费用(5)其它2.实验材料费18.6500(1)原材料/试剂/药品购置费17.3000细胞分离,免疫印迹,引物合成,RT-PCR、质粒构建和转染试剂,细胞生物学试剂(2)其它1.3500实验动物及相关费用3.仪器设备费0.8000(1)购置0.8000补充移液枪、小型
6、电泳仪(2)试制4.实验室改装费5.协作费0.0000二.国际合作与交流费2.00001.项目组成员出国合作交流1.0000中前期实验结果交流和商讨2.境外专家来华合作交流1.0000中后期实验结果交流和商讨三.劳务费1.2000象征性地支付中日双方相关工作人员四.管理费科研管理费合 计25.6500与本项目相关的其他经费来源国家其他计划资助经费其他经费资助(含部门匹配)其他经费来源合计0.0000报告正文(一)立项依据与研究内容(4000-8000字): 1. 项目的立项依据银屑病是一种多基因遗传背景下的免疫异常疾病,因其具有发病率较高和主要累及青壮年等特点而在皮肤科临床和科研领域倍受重视。
7、从病理学上看,角质形成细胞增殖和分化的异常,角质层中性粒细胞聚集所形成的Munro微脓疡以及真皮浅层血管周围以淋巴细胞为主的炎症细胞浸润是银屑病的三个最主要的特点。尽管三者之间存在非常复杂的相互作用和因果关系,但一般认为,真皮内聚集并活化的T淋巴细胞是银屑病皮损发生的始动因素,活化的T细胞可产生bEGF,INF-和IL-8等细胞/趋化因子,从而导致表皮角质形成细胞增殖和分化状态的异常并诱导中性粒细胞表皮内趋化和聚集1。 从目前银屑病的药物治疗手段上看,维A酸类药物和蒽林的主要作用机理是调节角质形成细胞的异常增殖和分化状态;传统免疫抑制剂 (糖皮质激素和MTX等)以及新型免疫抑制剂(环孢素A,他
8、克莫司,匹美克莫司,西洛莫司等)的主要作用机理是抑制T细胞的增殖和活化;细胞/趋化因子(TNF-,CD4,CD25,CD11a,IL-2R,IL-6R,IL-12等)抗体主要是阻断T细胞活化及其相关作用;IL-8抗体主要是阻断中性粒细胞的趋化。但由于以上药物治疗手段各自不同的副作用和作用靶环节的相对单一性,其治疗效果及运用前景尚不能完全令人满意。因此,我们需要寻找同时参与银屑病多个病理生理学环节的新的靶分子及其适当的抑制途径,从而为开辟银屑病新的研究领域和探寻银屑病新的治疗手段提供理论依据。Basigin/CD147分子是一种属于免疫球蛋白超家族成员的新型跨膜糖蛋白,本研究组成员曾首次克隆该分
9、子并发现它广泛存在于不同组织和细胞中,在细胞粘附及胚胎发育等方面发挥重要作用2。本研究群体从1998年开始围绕CD147在角质形成细胞异常增殖和分化以及皮肤肿瘤中的作用及机制开展了系列研究,并取得了一些原创性的科研成果:首先是明确了CD147位于角质形成细胞膜微绒毛的超微分布特点,从而提示这一分子可能在细胞粘附、细胞内外分子协同作用以及细胞膜受体等方面发挥重要作用3;然后,我们又利用大量实验首次发现:在皮肤鳞状细胞癌及恶性黑色素瘤的肿瘤细胞膜上CD147的表达显著增高,增高表达的CD147分子可以通过诱导肿瘤细胞周围成纤维细胞表达基质金属蛋白酶(MMPs),从而在多种皮肤肿瘤的浸润和转移中发挥
10、作用4-7;另外,我们还率先证实了CD147与生理和病理状态下角质形成细胞分化状态密切相关,是一种新的低分化角质形成细胞的标志蛋白,并可能发挥抑制角质形成细胞分化的作用3,7-9,从而在“角质形成细胞分化异常”这一层面上为开辟银屑病新的科研领域提供了一个很有价值的靶分子。更为引起我们重视的是,几乎所有的T细胞淋巴瘤细胞中均有CD147分子的增高表达10,CD147还被证明与T细胞的发育11、分化12,特别是活化13密切相关。Kasinrerk 等的早期研究发现,经PHA诱导活化的T细胞中CD147的表达显著增高13;进一步的研究发现,T细胞膜上的CD147分子可以参与CD3介导的T细胞活化14
11、;CD98是一种与T细胞等炎症细胞活化和聚集密切相关的分子,而CD147抗体能抑制CD98介导的炎症细胞聚集15;最近的研究显示,T细胞膜上的CD147分子可能是通过受体-配体的信息传导作用影响T细胞的增殖与活化16。亲环素(cyclophilin, CyP)是一种保守的蛋白家族,存在于包括T细胞在内的多种人体细胞中, CyP家族有CyPA、CyPB、CyPC、CyPD等成员,其分子量以及亚细胞定位各不相同。该组蛋白有两个共同特征,一是具有肽基脯氨酸顺/反异构酶活性,可催化细胞内蛋白质的折叠和转运;二是能与进入细胞内的免疫抑制剂(环孢素A等)结合形成复合物,该复合物可抑制神经钙调磷酸酶,进而抑
12、制T细胞核活化因子(NFAT),导致活化T细胞的相关细胞因子基因不能转录和翻译,阻断T细胞信号传递从而实现环孢素A的免疫抑制作用。此外, CyP还可被活化的T细胞分泌,以细胞因子样的方式参与多种生理和病理过程。CyPA是CyP家族的主要成员,由165个氨基酸组成,相对分子量18kDa,约占细胞蛋白总量的0.10.4,主要位于胞质内。可由T细胞等炎症细胞分泌,是一种嗜中性粒细胞17、T细胞18和嗜酸性粒细胞19的趋化因子。实验证实CyPA的受体与人CD147 cDNA 的核苷酸排列有97的同源性,作为CyPA的受体,CD147可以在CyPA介导的信号传递中发挥重要作用20。作为艾滋病毒整合CyP
13、A分子的受体,CD147参与了艾滋病毒进入和感染宿主细胞的过程21。最新的研究显示,CyPA可以调节细胞膜上CD147的表达水平22,23。CyPB是CyP家族的另一主要成员,主要存在于细胞内质网中,并可分泌到细胞外在细胞间信号传导中发挥作用。有研究证实,CD147也是CyPB的细胞膜受体,CD147抗体可阻断CyPB介导的嗜中性粒细胞趋化24。Allain等发现,CyPB可通过促进T细胞膜上41和47整合素的活化而增强T细胞向细胞外基质的粘附,T细胞膜上的CD147是这一信号传导过程中不可缺少的协同刺激分子18。 小干扰RNA(siRNA)是一种新近发现的诱导细胞内特定基因沉默的技术。它通过
14、向细胞内导入长度为21-23的核苷酸序列,高度特异性地降解同源mRNA序列,从而有效地阻止相应蛋白质的表达。近年的研究发现,将目标基因siRNA转染原代培养T细胞是一种有效的基因治疗手段,在艾滋病等免疫相关性疾病中有很好的临床运用前景25,26。本研究组也于近期成功构建CD147 siRNA 表达载体,将它转染恶性黑色素瘤细胞后可有效抑制CD147的表达27,28,从而为项目的顺利开展奠定了很好的实验基础。因为缺乏理想的动物模型,对银屑病发病机制的研究大多停留在体外实验阶段。严重联合免疫缺陷鼠(SCID鼠)因其独有的细胞和体液免疫缺陷特点,而被广泛运用于肿瘤学和器官移植等科研领域。有研究发现,
15、将银屑病患者皮肤移植到SCID鼠身上,有很高的移植存活率,且能较好地保存银屑病的临床、组织病理和免疫学特点29,30。因此,人银屑病皮损-SCID鼠移植模型被公认为目前最好的银屑病实验动物模型。国外有研究发现,在类风湿关节炎关节滑液中CyPA的水平和反应性中性粒细胞上CD147的表达水平与疾病的严重程度相关31,国内也有研究证实,在类风湿性关节炎滑膜组织的中性粒细胞和T细胞中有增高表达的CD147分子32。有学者发现,在银屑病患者的血清中CypA自身抗体的水平明显增高33,但国内外尚无有关CD147分子及其配体,CyPA和CyPB在银屑病发病机制中作用的报道。本研究中,我们将首先了解CD147
16、分子及其配体CyPA和CyPB在Jurkat T细胞,银屑病患者外周血炎症细胞和皮损中的表达情况;然后通过CD147 siRNA技术明确CD147分子在Jurkat T细胞和银屑病患者T细胞增殖、活化及基质黏附过程中的作用,以及在CyPA和CyPB介导的中性粒细胞趋化过程中的作用;最后建立人银屑病皮损-SCID鼠移植动物模型,并通过该模型进一步明确CD147 siRNA能否在体内实验条件下缓解银屑病皮损发展的进程。本研究的最终目的在于,明确CD147分子在银屑病T细胞活化和基质黏附以及中性粒细胞趋化等重要发病环节中的作用和机制,明确CD147 siRNA对人银屑病皮损-SCID鼠移植模型的效应
17、,为探寻银屑病新的研究领域和治疗方法提供理想的靶分子。参考文献1 Schaerli P, Britschgi M, Keller M, et al. Characterization of human T cells that regulate neutrophilic skin inflammation. J Immunol. 2004, 173:2151-8.2 Miyauchi T, Kanekura T, et al. Basigin, a new, broadly distributed member of the immunoglobulin superfamily, has st
18、rong homology with both the immunoglobulin V domain and the -chain of major histocompatibility complex class antigen. J Biochem 1990; 107: 316-23.3 Chen X, Kanekura T, Tsuyama S, et al. Ultrastructral localization of basigin in normal human epidermis. Histochem Cell Bio, 2001,115:465-70.4 陈翔,金藏拓郎,张桂
19、英等皮肤鳞状细胞癌转移灶中基质金属蛋白酶的表达湖南医科大学学报,2001,26:297-95 Kanekura T, Chen X, Kanzaki T. Basigin (CD147) is expressed on melanoma cells and induces tumor cell invasion by stimulating production of matrix metalloproteinases by fibroblasts.Int J Cancer, 2002, 99: 520-28.6 陈翔,金藏拓郎,张桂英等皮肤鳞状细胞癌中Basigin/CD147表达与肿瘤进展
20、的相关性中华皮肤科杂志,2002,35 (4):271-47 陈翔,李吉,谢红付等CD147在角质形成细胞分化过程中的表达和作用中华皮肤科杂志,2003,36:318-218 Chen X, Kanekura T, Kanzaki T. Expression of Basigin in human fetal, infantile and adult skin and in basal cell carcinoma. J Cutan Pathol, 2001,28:184-90.9 陈翔,吴东辉,谢红付等CD147在尖锐湿疣皮损中的表达及意义临床皮肤科杂志,2004,33:209.10 Nab
21、eshima K, Suzumiya J, Nagano M, et al. Emmprin, a cell surface inducer of matrix metalloproteinases (MMPs), is expressed in T-cell lymphomas. J Pathol. 2004, 202:341-51.11 Renno T, Wilson A, Dunkel C, et al. A role for CD147 in thymic development. J Immunol. 2002, 168:4946-50.12 Kirsch AH, Diaz LA J
22、r, Bonish B,et al. The pattern of expression of CD147/neurothelin during human T-cell ontogeny as defined by the monoclonal antibody 8D6. Tissue Antigens. 1997, 50:147-52.13 Kasinrerk W, Fiebiger E, Stefanova I, et al. Human leukocyte activation antigen M6, a member of the Ig superfamily, is the spe
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