NSFCproposal-龚朝辉.doc
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1、 国家自然科学基金申请书申请代码: 受理部门: 收件日期:受理编号:第 16 页 版本1.000.000国家自然科学基金申 请 书您现在不能检查保护文档或打印文档,请根据以下三个步骤操作: 1)如果您是Word2000或以上版本用户,请把Word宏的安全性设为:中 方法: Word菜单-工具-宏-安全性-安全级,设置为中 (如果您是Word97用户,继续执行以下步骤) 2)关闭本文档,重新打开本文档 3)点击启用宏按钮,即可开始填写本文档或打印了资助类别: 亚类说明: 附注说明: 项目名称: 申 请 者: 电话: 依托单位: 通讯地址: 邮政编码: 单位电话: 电子邮件: 申报日期: 2006
2、年3月20日国家自然科学基金委员会基本信息 申 请 者 信 息姓名性别男出生年月1978年11月民族汉族学位硕士职称助理研究员主要研究领域生物化学与分子生物学,基因工程 电话057186843190 电子邮件zhgong 传真057186843198 个人网页 工作单位浙江理工大学 /生命科学学院生物化学研究所在研项目批准号 依托单位信息名称代 码31001204 联系人张琪 电子邮件zhangqi 电话0571-86843052 网站地址 合作单位信息单 位 名 称代 码 项 目 基 本 信 息项目名称资助类别面上项目 亚类说明自由申请项目 附注说明 申请代码C01040102:核酸C010
3、401:生物分子的结构与功能、合成机理及调节过程基地类别 预计研究年限2007年1月 2008年12月研究属性基础研究 摘 要(限400字):MicroRNA(微RNA,miRNA)是一类长约22个核苷酸的小分子非编码RNA。尽管在相关的模式生物基因组中miRNA基因被大量的发现,但在家蚕发育环节中miRNA功能研究至今没有报道。家蚕既是一种能吐丝的经济动物,同时又能作为生物反应器生产药用重组蛋白。本研究以家蚕为模式生物,开展对家蚕发育过程中不同时期的miRNA研究,确定其miRNA基因序列,并选择性地研究若干重要miRNA基因的结构模式和功能,以此来分析家蚕在不同成长时期蛋白质的表达调控模式
4、。我们通过确定miRNA分子在家蚕生长和发育分化中的作用,来进一步阐明影响家蚕经济性状的分子机理并在分子水平上揭示家蚕发育和生理过程,填补国内外在家蚕miRNA领域研究的空白。关 键 词(用分号分开,最多5个)家蚕;微RNA;RNA干涉;转录调控;表达 项目组主要成员(注: 项目组主要成员不包括项目申请者,国家杰出青年科学基金类项目不填写此栏。)编号姓 名出生年月性别职 称学 位单位名称电话电子邮件项目分工每年工作时间(月)11977-12-18 女助理研究员博士浙江理工大学 057186843194 jcyacai 杂交分析 3 21977-2-22 男助理研究员硕士浙江理工大学 05718
5、6843194 liu16 序列比对分析 3 31975-12-18 男讲师硕士浙江理工大学 057186843194 wuxinzm miRNA基因鉴定 4 41974-1-1 女博士生硕士浙江理工大学 057186843190 xhlong0717 miRNA功能分析 3 51978-1-1 女博士生硕士浙江理工大学 057186843190 lanhl miRNA靶标鉴定 3 6 7 89总人数高级中级初级博士后博士生硕士生0说明: 高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报(含申请者),总人数自动生成。经费申请表 (金额单位:万元)科目申请经费备注(计算依据与说明)
6、一.研究经费25.75001.科研业务费15.7500(1)测试/计算/分析费8.5000cDNA文库构建、cDNA测序、Northern Blot分析(2)能源/动力费1.2500按照5计算(3)会议费/差旅费3.0000国内外学术交流(4)出版物/文献/信息传播费3.0000版面费,专利申请费(5)其它2.实验材料费10.0000(1)原材料/试剂/药品购置费8.0000各种分子生物学实际,细胞培养,体外转录,免疫检测试剂等(2)其它2.0000常规实验耗材等3.仪器设备费0.0000实验设备齐全,无需购置(1)购置(2)试制4.实验室改装费实验室条件完好,无需改装5.协作费二.国际合作与
7、交流费4.00001.项目组成员出国合作交流2.0000拟派1名项目组骨干成员去国外短期学习2.境外专家来华合作交流2.0000聘请国外专家来访讲学三.劳务费4.0000按不超过15四.管理费1.5000按不超过5计算合 计35.2500与本项目相关的其他经费来源国家其他计划资助经费其他经费资助(含部门匹配)其他经费来源合计0.0000报告正文(一)立项依据与研究内容(4000-8000字): 1. 项目的立项依据MicroRNA(微RNA,miRNA)是一类长约22个核苷酸的小分子非编码RNA。miRNA可以通过与靶基因mRNA的特定位点结合,抑制该蛋白的合成或诱导该mRNA的降解,从而参与
8、基因的表达调控1-3。miRNA 在各种生物中普遍存在, 现已从动物的线虫、果绳、家鼠、人体及植物的拟南芥中都分离到了miRNA 412。 查询专业的miRNA数据库miRBase(http:/microrna.sanger.ac.uk/)得知,目前已经发现有3000多条miRNA序列,但其中只有一半的的miRNA功能通过实验确定13, 14。序列同源性比对发现在其他物种中也存在大量miRNA,其数量远未达到饱和。此外,除了少数几个如lin-4、let-7等的功能研究得比较清楚外,大多数的miRNA的生理功能尚不清楚。因此,开展对几种常见的模式生物的miRNA研究是至关重要的。微RNA分子的序
9、列短小,在基因组中存在较多的互补序列,在不同生物体内与靶标结合的方式也不尽相同,而且通常还与多种蛋白相互作用,这使得建立一个有效而且普遍适用的研究方法异常困难。虽然如此,科学家仍在不断努力,并在miRNA基因鉴定、生理功能和靶标研究中取得了明显的突破。在各种小分子RNA中,miRNA是一类长度很短的非编码调控单链小分子RNA,长度在18-26nt,是由一段具有发夹结构的长度为70-100nt的单链RNA前体(pre-miRNA)剪切后生成。微RNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中,而且绝大部分定位于基因间隔区。其转录独立于其他基因,并不翻译成蛋白质,而是在体内代谢过程中起到
10、多种调控作用。它通过与目标mRNA基因的3端非编码区域(3UTR)互补匹配导致该mRNA基因的翻译受到抑制。由于miRNA在各个物种间具有高度的进化保守性,并且在茎部的保守性更强;但在环部可以容许更多的突变点存在。基于这些特点,使得运用多种实验方法以及生物信息学方法来预测和确定miRNA成为可能15-26。众所周知,家蚕既是非常重要的经济昆虫,又是极其重要的模式生物。作为模式动物与哺乳动物基因组相比,家蚕基因组相对简单,且个体较大。其单倍体完全基因组长度为450M左右,共有28对染色体。这给细胞生命活动的机理及发育生物学研究提供了一个非常合适的材料。此外,家蚕在基础生命体系、物质代谢、能量代谢
11、和遗传方式上与人类有很大的相似性。家蚕遗传资源存在大量疾病模型,如癌症模型、糖尿病模型、发育畸形模型等。通过研究这些遗传模型,将在克隆人类疾病控制新基因、研究疾病机理和开发新药物上发挥重大作用,对解决人类疾病、寿命等重大问题具有重要参考价值。另外,家蚕是理想的生物反应器,家蚕体内的丝腺是一个高效率的蛋白质工厂,通过基因组研究,彻底阐明茧丝生产的调控机理,可使家蚕生产对人类有益的高纯度药用蛋白质。在各种小分子RNA中,microRNA是一类长度很短的非编码调控单链小分子RNA,长度在18-26nt,是由一段具有发夹结构的长度为70-100nt的单链RNA前体(pre-miRNA)剪切后生成。Mi
12、croRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中,而且绝大部分定位于基因间隔区。其转录独立于其他基因,并不翻译成蛋白质,而是在体内代谢过程中起到多种调控作用。它通过与目标mRNA基因的3端非编码区域(3UTR)互补匹配导致该mRNA基因的翻译受到抑制。由于microRNA在各个物种间具有高度的进化保守性,并且在茎部的保守性更强;但在环部可以容许更多的突变点存在。这些特点,使得利用生物信息学的方法来预测microRNA成为可能1-18。最早发现的microRNA是在线虫的let-7和lin-4。运用多种实验方法以及生物信息学方法,至今已找到了3518种 microRNA基因序列1
13、9-21,并被收入专门的数据库 miRBase 数据库。根据microRNA的大小、丰度以及其生物来源,国际上提出了一套通用的microRNA命名和注释的标准:(1)通过Northernd杂交可以从以大小分级的RNA样品中检测到18-26nt的转录物;(2)可以从以大小分级的cDNA文库中分离得到,且来源是所建库的生物基因组;(3)有能形成发夹结构的前体,且该发夹结构中的一条臂上包含有microRNA序列,发夹必须是具有最低能量的预测结构;此外发夹结构的其中一条臂上必须含有22nt microRNA核苷酸中的至少16nt预测的结构中不应该有大的内部环或泡,特别是不能有大的不对称的泡;(4)进化
14、上高度保守的microRNA和它的发夹结构前体,保守的发夹要符合标准(3)中的最小配对碱基的要求,但不必是能量最低;(5)随着Dicer酶的功能活性降低,可以检测到生物体中前体的积聚。在与家蚕近缘昆虫(例如果蝇、蜜蜂、蚊子等)microRNA研究中,已发现了上百种microRNA。其中在Anopheles gambiae中发现了38种,Apis mellifera 中找到了25种,Drosophila melanogaster中发现了78,Drosophila pseudoobscura 中有73种21。在这些microRNA序列中,仅有78个是非100%相似的。这些microRNA序列、结构
15、、丰度和表达方式的多样性使其可能作为mRNA表达的调节子,对基因表达、细胞周期调控乃至个体发育过程都起了重要的调控作用。尽管在相关的模式生物基因组中microRNA基因被大量的发现,但在家蚕发育环节中microRNA功能研究至今没有报道。在家蚕发育过程中各个变态期是否存在microRNA基因? 它们的结构如何?功能如何?在家蚕蛹期调控作用机制是什么?家蚕作为模式生物具有非常重要的生物学特征和比较清楚的遗传背景。家蚕既是一种能吐丝的经济动物,同时又能作为生物反应器表达药用重组蛋白,在理论上研究与家蚕发育分化节律调控相关的microRNA,对于深刻认识家蚕体内复杂调控机理具有重要意义。本研究以家蚕
16、为模式生物,开展对家蚕发育过程中不同时期的miRNA研究,确定其miRNA基因序列,并选择性地研究若干重要miRNA基因的结构模式和功能,以此来分析家蚕在不同成长时期蛋白质的表达调控模式。确定miRNA分子在家蚕生长和发育分化中的作用,进一步阐明影响家蚕经济性状的分子机理并在分子水平上揭示家蚕发育和生理过程,填补国内外在家蚕miRNA领域研究的空白。 主要参考文献:1 Bartel DP. (2004) MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell, 116, 2812972 Filipowicz W, Jaski
17、ewicz L, Kolb FA. and Pillai RS. (2005) Post-transcriptional gene silencing by siRNAs and miRNAs. Curr. Opin. Struct. Biol., 15, 3313413 Sontheimer EJ. and Carthew RW. (2005) Silence from within: endogenous siRNAs and miRNAs. Cell, 122, 9124 Lagos-Quintana M, Rauhut R, Lendeckel W, et al. (2001) Ide
18、ntification of novel genes coding for small expressed RNAs. Science, 294(5543): 853-8585 Lau NC, Lim LP, Weinstein EG, et al. (2001) An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science, 294(5543): 858-8626 Lee RC, Ambros V. (2001) An extensive class of sm
19、all RNAs in Caenorhabditis elegans. Science, 294 (5543):862-8647 Mourelatos Z, Dostie J, Paushkin S, et al. (2002) miRNPs: a novel class of ribonucleoproteins containing numerous microRNAs. Genes Development, 16(6):720-7288 Lagos-Quintana M, Rauhut R, Yalcin A, et al. (2002) Identification of tissue
20、-specific microRNAs from mouse. Current Biology, 12 (9):735-7399 Llave C, Kasschau KD, Rector MA, et al. (2002) Endogenous and silencing-associated small RNAs in plants. Plant Cell, 14(7):1605-161910 Reinhart BJ, Weinstein EG, Rhoades MW, et al. (2002) MicroRNAs in plants. Genes Development, 16(13):
21、1616-162611 Lagos-Quintana M, Rauhut R, Meyer J, et al. (2003) New microRNAs from mouse and human. RNA, 9(2):175- 17912 Dostie J, Mourelatos Z, Yang M, et al. (2003) Numerous microRNPs in neuronal cells containing novel microRNAs. RNA, 9(2):180- 18613 Griffiths-Jones S. The microRNA Registry.Nucleic
22、 Acids Res 32:D109-D111(2004).14 Griffiths-Jones S, Grocock RJ, van Dongen S, et al. (2006) miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Res., 34:D140-D14415 Aravin AA, Lagos-Quintana M, Yalcin A, et al. (2003) The small RNA profile during Drosophila melanogaster develop
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