2012CB966600 中胚层干细胞自我更新分化的机制与功能研究.doc
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1、项目名称:中胚层干细胞自我更新分化的机制与功能研究首席科学家:冯新华 浙江大学起止年限:2012.1至2016.8依托部门:教育部 浙江省科技厅一、关键科学问题及研究内容本项目通过建立合适的组织特异性、基因特异性的技术体系及可视化的动物模型平台,对中胚层体内干细胞的自我更新和分化进行研究,深入了解中胚层组织生理调控的信号通路与疾病发生的机制,找到合适的干预靶点,获得有力的调控手段,最终开拓新的治疗方式。 1、建立体内中胚层干细胞示踪技术体系:建立组织特异性荧光报告系统果蝇、斑马鱼及小鼠模型,用于体内动态监测中胚层干细胞的自我更新和分化;建立中胚层来源组织疾病模型,为以下研究内容的开展奠定基础。
2、 2、揭示信号通路对中胚层干细胞体内自我更新和分化的生理调控机制:以体内中胚层干细胞示踪技术体系、基因敲除手段和体外干细胞培养模型相结合,研究重要信号通路(TGF-、PI3K-mTOR、Wnt等)和关键基因对中胚层干细胞自我更新和分化的调控机制。 3、阐明中胚层干细胞在病理条件下的作用和机制:研究重要信号通路(TGF-、PI3K-mTOR、Wnt等)、关键基因以及炎症因子所导致的中胚层干细胞自我更新和分化异常,及其相关的中胚层来源组织重大疾病(白血病、心肌/肾脏纤维化、不育症、骨关节炎)的发生发展。 4、探索中胚层组织干细胞自我更新和分化的诱导调控手段及疾病治疗方法:利用果蝇和斑马鱼的中胚层干
3、细胞的示踪模型和体外干细胞培养模型,筛选针对重要信号通路(TGF-、PI3K-mTOR、Wnt等)的小分子化合物,尝试体内外诱导调控中胚层组织干细胞的自我更新和分化,并进一步优化中胚层干细胞的移植技术体系,为探索以治疗中胚层组织来源疾病治疗新方法奠定基础。二、预期目标以满足国家战略需求和改善人民生活质量为目标,着眼发育生物学和再生医学研究前沿,围绕中胚层组织干细胞体内自我更新和分化的机制和功能,建立体内中胚层干细胞示踪技术体系、揭示信号通路对中胚层干细胞体内自我更新和分化的生理调控机制,阐明中胚层干细胞在病理条件下的作用和机制,探索中胚层组织干细胞自我更新和分化的诱导调控手段及疾病治疗方法。通
4、过本课题的实施,在中胚层组织干细胞领域取得理论创新和突破,获得一批拥有自主知识产权的成果。同时,以本项目的实施为契机,进一步加快我国干细胞研究与再生医学、免疫和遗传等领域的衔接和交叉,形成高水平的学术研究人才梯队。 1、建立中胚层干细胞体内示踪模型以及中胚层来源组织疾病模型,动态观察生理和病理情况下体内中胚层干细胞自我更新和分化的过程。 2、明确重要信号通路(TGF-、PI3K-mTOR、Wnt等)和关键基因调控中胚层干细胞自我更新和分化的作用;绘制以几大通路为中心的中胚层组织干细胞自我更新和分化的调控网络,进而为建立活体中组织干细胞自我更新和分化的干预体系提供理论基础。 3、在中胚层来源组织
5、重大疾病(白血病、心肌/肾脏纤维化、不育症、骨关节炎)模型中,阐明重要信号通路(TGF-、PI3K-mTOR、Wnt等)、关键基因以及炎症因子在中胚层干细胞自我更新和分化异常中的作用。 4、获得针对重要信号通路(TGF-、PI3K-mTOR、Wnt等)的小分子化合物,建立体内外诱导调控中胚层组织干细胞的自我更新和分化的手段,完善中胚层干细胞的移植技术体系,尝试性干预中胚层来源组织疾病。 5、取得具有国际影响的成果,发表SCI论文30-50篇(影响因子大于10的5-10篇);申请发明专利5-10项。 6、人才培养:培养博士后10-20人,博士40-60人,硕士20-40人;争取1-2人获得全国百
6、篇优秀博士论文;培养一批从事干细胞研究的高水平人才。三、研究方案人体中有许多重要器官均由中胚层形成,包括心脏、血液、肾脏、肌肉骨骼和生殖系统。随着我国人口老龄化和社会生活节奏的加快,各种中胚层疾病,如心血管疾病、白血病、骨关节疾病、不孕不育,越加频繁发生,严重影响了人们的生活质量。并且中胚层系统疾病发病率高,后遗症多,难以治愈,损失了大量劳动力,给国家增加了极大负担。因此,中胚层疾病的治疗迫切需要从新的角度探索,从而为寻找新的治疗策略提供基础。而干细胞研究的兴起为中胚层系统疾病的治疗带来了新的希望。大量研究表明干细胞治疗可促使身体自主再生已损伤组织,利用干细胞与组织工程技术相结合所得到的生物工
7、程组织或器官能够直接移植到损伤部位,实现再生,从而有可能提供新的疾病治疗方案和手段。因此,建立体内干细胞自我更新和分化的研究体系,阐明中胚层特定组织干细胞在生理病理中的作用及其机制,建立有效干预手段,对于应用干细胞防治中胚层疾病(如心血管疾病、白血病、骨关节炎等)具有十分重要的意义。已有的项目总体思路为:建立体内干细胞自我更新和分化的研究体系,阐明中胚层特定组织干细胞在生理病理中的作用及其机制,获得有效干预手段,改善中胚层组织疾病的治疗效果。根据总体思路,本项目设立了紧密联系又各有侧重的四个课题组: 课题1、体内中胚层干细胞示踪技术体系的建立:以果蝇、斑马鱼及小鼠为模型,建立组织特异性荧光报告
8、系统。研究关键基因在组织干细胞分化,早期发育中的生物学功能;对基因敲除小鼠的干细胞数量和增殖分化能力进行动态评估。课题2、信号通路对中胚层干细胞体内自我更新和分化的生理调控机制:利用干细胞与基因敲除动物模型,研究关键基因和重要信号通路(TGF-、PI3K-mTOR、Wnt等)对中胚层干细胞自我更新和分化的分子机制,进而为建立活体组织干细胞分化行为的人为干预体系提供理论基础。 课题3、中胚层干细胞在病理条件下的作用和机制:主要研究关键基因和重要信号通路(TGF-、PI3K-mTOR、Wnt等)调控中胚层干细胞自我更新、分化与疾病发生发展的分子机制,研究炎症因子对中胚层干细胞维持和分化的影响及分子
9、机理,发现关键的免疫调控因子及其作用机制。 课题4、中胚层组织干细胞自我更新和分化的诱导调控手段及疾病治疗方法:基于课题一的平台与二、三发现的信号通路与免疫靶点诱导调控干细胞自我更新和分化,利用组织特异性和基因特异性的动物模型和体外干细胞培养模型筛选小分子化合物;完善中胚层干细胞的分离、培养和分化的技术平台;建立干细胞移植技术体系;探索运用干细胞诱导调控手段治疗中胚层组织来源疾病。 研究方案从关注组织干细胞在体内自我更新和分化的前沿科学问题出发,建立可视化的组织特异性及基因特异性的研究平台(课题一),研究组织干细胞在体内自我更新和分化的生理机制(课题二)及病理机制(课题三),找到其调控靶点,向
10、调控组织干细胞促进疾病治疗的应用研究(课题四)过渡。从而实现多层次、多角度、递进性、综合性地研究中胚层组织疾病的治疗的技术路线。各课题之间联系及其与本项目的研究目标之间的关系图如下:课题的研究目标、内容、承担单位、课题负责人及课题在整个项目经费中所占比例:课题1. 体内中胚层干细胞示踪技术体系的建立研究目标: 建立中胚层干细胞体内示踪模型以及中胚层来源组织疾病模型,动态观察生理和病理情况下体内中胚层干细胞自我更新和分化的过程。研究内容:(1)果蝇模型:采用转基因技术,构建荧光标记的已知干细胞标记分子的转基因果蝇株,对中胚层干细胞进行示踪。进而利用前期工作积累的一个果蝇致死突变株库(约有2000
11、个突变株)对调节中胚层干细胞(如生殖干细胞)自我更新和分化的新基因进行正向遗传筛选。在此基础上,对这些筛出的突变所影响的基因进行定位克隆并对其作用机制及与重要信号通路(TGF-、PI3K-mTOR、Wnt等)的作用关系进行深入研究。(2)建立斑马鱼中胚层干细胞示踪的转基因品系:一方面利用已知的中胚层干细胞标记基因以及全身透明的casper突变体,建立示踪斑马鱼中胚层干细胞的转基因品系(如血液干细胞、肌肉干细胞及肾脏干细胞);另一方面,通过移植的方法,鉴定特定中胚层组织干细胞(如生殖干细胞及软骨干细胞等),并找到新的中胚层干细胞标记基因。结合小分子化合物筛选和定向突变技术,研究重要信号通路(TG
12、F-、PI3K-mTOR、Wnt)对中胚层干细胞自我更新和分化的作用关系。(3)构建标记中胚层干细胞的转基因荧光小鼠:利用已知的以及通过上述果蝇和斑马鱼系统鉴定出的新的中胚层干细胞标记基因,建立示踪小鼠中胚层干细胞的转基因及相应的Cre品系,研究重要信号通路(TGF-、PI3K-mTOR、Wnt)对中胚层干细胞自我更新和分化的调控关系。同时,利用上述斑马鱼筛选到的小分子化合物,在建立的小鼠模型中进行验证。(4)利用上述建立的示踪系统,建立中胚层来源组织疾病(白血病、心肌/肾脏纤维化、不育症、骨关节炎)模型,动态观察病理情况下体内中胚层干细胞自我更新和分化的过程。经费比例: 23% 承担单位:
13、同济大学课题负责人: 曹莹学术骨干: 佟超,谢晓云,许静课题 2. 信号通路对中胚层干细胞体内自我更新和分化的生理调控机制研究目标: 阐明重要信号通路(TGF-、PI3K-mTOR、Wnt等)和关键基因调控中胚层干细胞自我更新和分化的作用;绘制以上述重要信号通路为中心的中胚层组织干细胞自我更新和分化的调控网络,进而为建立活体中组织干细胞自我更新和分化的干预体系提供理论基础。研究内容:利用干细胞培养模型及突变体动物模型,结合上述示踪系统,研究重要信号通路(TGF-、PI3K-mTOR、Wnt等)和关键基因对中胚层干细胞自我更新和分化的调控机制,进而为体内干预中胚层组织干细胞自我更新和分化提供理论
14、基础。(1)阐述TGF-信号通路在中胚层干细胞自我更新和分化过程中的作用与机理。利用干细胞培养模型及突变体动物模型,结合上述示踪系统,研究调控TGF-信号通路的重要磷酸酶PPM1A及SCP4等在中胚层干细胞自我更新和分化以及中胚层组织发育过程中的作用机制。(2)阐述PI3K-mTOR信号信号通路在中胚层干细胞自我更新和分化过程中的作用与机理。利用干细胞培养模型及突变体动物模型,结合上述示踪系统,研究PI3K-mTOR信号通路的重要成员PTEN、AKT、mTOR等在中胚层干细胞自我更新和分化以及中胚层组织发育过程中的作用机制。(3)阐述Wnt信号通路在中胚层干细胞自我更新和分化过程中的作用与机理
15、。利用干细胞培养模型及突变体动物模型,结合上述示踪系统,研究Wnt信号通路的重要成员-catenin及wntless等在中胚层干细胞自我更新和分化以及中胚层组织发育过程中的作用机制。经费比例: 31%承担单位: 浙江大学 课题负责人: 冯新华学术骨干: 杨中州,陶涛,刘婷,肖睦课题3. 中胚层干细胞在病理条件下的作用和机制研究目标:阐明中胚层干细胞在病理条件下的作用和机制:研究重要信号通路(TGF-、PI3K-mTOR、Wnt等)、关键基因以及炎症因子所导致的中胚层干细胞自我更新和分化异常,及其相关的中胚层来源组织重大疾病(白血病、心肌/肾脏纤维化、不育症、骨关节炎)的发生发展。研究内容: (
16、1)利用斑马鱼及小鼠疾病模型,结合上述示踪系统,阐明TGF-信号通路和关键蛋白在中胚层干细胞自我更新和分化异常中的作用,从而揭示TGF-信号通路在中胚层来源组织疾病(骨髓衰竭疾病、不育症、骨关节炎)发生发展中的作用与机理。 (2)利用小鼠疾病模型,结合上述示踪系统,阐明PI3K-mTOR信号通路和关键蛋白在中胚层干细胞自我更新和分化异常中的作用,从而揭示PI3K-mTOR信号通路在中胚层来源组织疾病(白血病、不育症)发生发展中的作用与机理。 (3)利用斑马鱼及小鼠疾病模型,结合上述示踪系统,阐明Wnt信号通路和关键蛋白在中胚层干细胞自我更新和分化异常中的作用,从而揭示Wnt信号通路在中胚层来源
17、组织疾病(心脏纤维化、不育症、骨关节炎)发生发展中的作用与机理。 (4)利用斑马鱼及小鼠疾病模型,结合上述示踪系统,阐明炎症因子在中胚层干细胞自我更新和分化异常中的作用,从而揭示炎症因子在中胚层来源组织疾病(白血病、肾脏纤维化、骨关节炎)发生发展中的作用与机理。 经费比例: 23% 承担单位: 浙江大学课题负责人: 汪洌学术骨干: 冯立新,胡虎,竺晓凡,李昂课题4. 中胚层组织干细胞自我更新和分化的诱导调控手段及疾病治疗方法研究目标:探索中胚层组织干细胞自我更新和分化的诱导调控手段及疾病治疗方法:利用果蝇和斑马鱼的中胚层干细胞的示踪模型和体外干细胞培养模型,研究发现针对重要信号通路(TGF-、
18、PI3K-mTOR、Wnt等)来诱导调控中胚层组织干细胞的自我更新和分化的安全而有效的小分子化合物,并进一步优化中胚层干细胞的移植技术体系,为建立治疗中胚层组织来源疾病治疗的新方法奠定基础。 研究内容:(1)基于组织干细胞自我更新和分化的机制,利用上述小分子筛选平台和功能检测系统,以课题2、3发现的新靶点为对象,并针对其分子调控机制设计合理的分子筛选模型,筛选出能够安全有效地促进中胚层干细胞扩增的活性小分子化合物,而后进行药物效应验证和进一步的分子机制研究,从而发现可安全有效地的诱导调控中胚层组织干细胞的自我更新和分化的小分子化合物,为相关新药研发和干细胞治疗中胚层组织来源疾病打基础。a)利用
19、上述果蝇和斑马鱼中胚层干细胞示踪系统和疾病模型,以重要信号通路(TGF-、PI3K-mTOR、Wnt等)为作用对象,筛选对中胚层干细胞自我更新和分化具有关键调控作用的小分子化合物。b)利用小鼠中胚层来源组织疾病模型验证我们已有的重要信号通路(TGF-、PI3K-mTOR、Wnt等)特异性激活/抑制分子,以及新筛选出的对中胚层干细胞自我更新和分化有关键调控作用的小分子化合物。探索中胚层组织来源疾病的新干预手段。(2)依据炎症因子对中胚层组织干细胞自我更新分化的影响和作用靶点,筛选特异性的小分子抑制物,并在小鼠中胚层来源组织疾病模型中验证,探索免疫干预手段。(3)利用斑马鱼干细胞示踪系统筛选出的新
20、的中胚层干细胞标志基因,完善干细胞的分离技术。结合干细胞示踪模型筛选出的对中胚层干细胞自我更新和分化有关键影响的小分子化合物,优化干细胞自我更新和诱导技术体系,探索建立有效的中胚层干细胞移植治疗手段。经费比例: 23% 承担单位:中国医学科学院血液学研究所课题负责人:袁卫平学术骨干:欧阳宏伟,高瀛岱,王琳琳,连晓媛四、年度计划研究内容预期目标第一年1) 用esg-Gal4 驱动UAS- GFP表达或STAT92E-GFP标记肾脏干细胞,并摸索在马氏管中诱导产生克隆的条件。2) 利用已有的斑马鱼肾脏干细胞转基因品系Tg(lhx1a:GFP),通过流式细胞仪、芯片技术以及表达谱筛选,找到新的特异性
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