人类非编码RNA及其介导的基因表达调控.doc
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1、项目名称:人类非编码RNA及其介导的基因表达调控首席科学家:屈良鹄 中山大学起止年限:2005.12至2010.11依托部门:广东省科技厅 教育部一、研究内容本项目要解决的关键科学问题是“人类非编码RNA的多样性及其与生命现象和重大疾病的关系” 。 人类基因组中编码蛋白质的基因不到3万个,约占整个基因组序列的2, 远远低于人类基因组计划完成之先所预期的10万个基因。然而象酵母这么简单的单细胞真核生物,其基因组也编码6000个基因。远比人低等的秀丽广杆线虫(Caenorhabditis elegans)竟然也有2万个蛋白质编码基因;而比线虫更为复杂的果蝇,其基因组中的蛋白质基因数目(1.4万)甚
2、至少于线虫。显然,仅仅按照生物体的基因数目的多少无法解释不同生物体的复杂度。科学家们认为高等生物拓宽其分子水平差异并不取决基因的数目,而主要依靠对基因表达的调控来完成。在哺乳动物中基因表达调控有两个重要策略:1. 通过对人类基因组转录的mRNA前体中内含子和外显子的可变剪接加工等,从一个基因可以产生大量的蛋白同源异形体,大大增加了蛋白组的复杂度。目前参与可变剪接的顺式元件和反式因子的鉴别及其调控机制正急待阐明。2. 人类基因组的非蛋白质编码区中实际上编码了大量的非编码RNA,由这些RNA组成了细胞中高度复杂的RNA调控网络。发现和鉴定这些非编码RNA及其相关蛋白质在基因表达调控中的作用是RNA
3、组学的首要任务。围绕上述科学问题,本项目拟以人和哺乳动物为主要模式生物,研究非编码RNA及其相关的RNA结合蛋白的系统识别和鉴定及其在正常和病变细胞中对基因表达的调控作用。主要包括:1.建立和发展各种高通量、专一性RNA组学技术平台和基因组范围内RNA调控蛋白筛选体系,大规模地鉴定新的非编码RNA和RNA顺式元件及其相互作用的蛋白质。2.以正常和病变的细胞为对象,建立一套新的非编码RNA的功能研究体系,着重阐明小分子非编码RNA在细胞的分化过程和肿瘤细胞发生过程中的作用。3. 研究非编码RNA与蛋白质的相互作用的机制,阐明其在基因表达调控中的作用。二、预期目标本项目的总体目标瞄准当前生命科学前
4、沿,开展对人类非编码RNA及其介导的基因表达调控的研究,大规模地解析人类基因组非编码DNA中的遗传信息。建立和发展一系列RNA组学以及RNA与蛋白质相互作用的研究体系,着重阐明生命现象和人类重大疾病中的RNA调控网络,使我国在RNA组学、RNA调控机制以及RNA与肿瘤发生等几个前沿领域取得突破性进展,并跻身于国际先进行列。 本项目的五年预期目标1) 建立起一系列创新性的RNA组学研究体系,使我国在非编码RNA的大规模分析和基因组注释等基础性研究的前沿领域进入国际先进行列。(1)建立起适合于人类基因组分析的计算机RNA组学和实验RNA组学平台,全面注释人类基因组中snmRNA基因。(2)建立起适
5、合于人类基因组分析的快速的工作流式的计算机miRNA分析平台,系统地分析人基因组中的miRNA基因及其靶基因,预测miRNA的功能。(3)建立一个新的算法能够大规模搜索人类基因组中SR蛋白的识别序列,并建立SR蛋白特异性的和非特异性的ESE细胞内筛选技术平台进行鉴定。2) 在人和哺乳动物等真核模式生物中,系统地发现和鉴别一大批新的非编码RNA及其相关的RNA结合蛋白 ,解析一批非编码RNA的生物学功能及其与蛋白质的相互作用,阐明人类细胞分化和个体发育中的RNA调控网络。(1)完成大规模筛选多种正常和病变细胞小分子非编码RNA 的cDNA文库,高效分离和发现一大批新的小分子非编码RNA。(2)完
6、成人类胚胎干细胞某些分化过程中的miRNA表达谱,找出与分化有关的几种特异miRNA,了解它们对细胞分化的作用。(3)建立基因组范围RNA干涉方法,鉴定出一批新的在可变剪接调控中起重要作用的RNA结合蛋白,并阐明其调控mRNA前体可变剪接的机制。(4)对加工miRNA的相关蛋白质,特别是Dicer作用的分子机理,以及加工过程中的质量控制机制研究方面取得重要进展,阐明相关蛋白质的作用形式,各个结构域的功能,与RNA相互作用的结构基础。3) 本项目将在“非编码RNA与人类重大疾病的关系”这一新的科学领域取得重要的进展,为人类认识肿瘤发生的分子机制和攻克癌症提供理论基础和新的技术。(1)发现和鉴别一
7、批与乳腺癌、肺癌、肝癌和成胶质细胞瘤等癌变相关的非编码RNA,揭示其与肿瘤发生的关系,及在不同肿瘤中的表达特征和功能意义,阐明肿瘤发生中的RNA调控机制,使我们对重大疾病的病因及分子机制得到深入的认识,并发现以RNA分子为对象的治疗靶标和早期诊断标识,为肿瘤等重大疾病的防治提供新的思路和方法。(2)克隆一批在人类心脏血管中参与调节基因表达的组织和细胞特异性miRNA,揭示其表达模式及其在相关器官发生和相关疾病发生中的调控机理。 以上研究成果,预期可以在国际杂志上发表一批高水平的研究论文。 优秀人才培养:除了10位主要的学术带头人外,本项目组织了49位优秀的中青年教师和研究人员参加(其中包括从国
8、外吸引的1位青年回国研究人员),预计将有80名研究生(博士研究生占一半以上)参加本项研究。因此,本项目的实施将为我国培养一批RNA科学和RNA技术方面的高级创新性人才。三、研究方案1.总体学术思路、技术路线及可行性1)学术思路:根据哺乳动物RNA的结构特点和生物学特性,建立和发展新的RNA组学的方法和RNA功能研究体系,着重在新的小分子非编码RNA基因及其相关蛋白的系统识别鉴定、加工和调控机制方面的探讨,在人类基因组非编码RNA的发现及其功能的研究中取得突破性的进展。 总体研究方案图示如下:l 细胞分化和发育过程中的小分子非编码RNA的大规模筛选、时空表达谱及功能研究。 l mRNA前体可变剪
9、接调控中顺式元件和反式因子的大规模鉴别及其作用机制。l 小分子非编码RNA生物合成过程及其与蛋白质相互作用的分子基础。RNA调控网络及机制RNA 与重大疾病l 计算机RNA组学l 实验RNA组学l SR蛋白特异性的和非特异性的ESE细胞内筛选技术平台l 基因组范围RNA干涉方法人类非编码RNA及其介导的基因表达调控以乳腺癌、胶质瘤细胞系等为模式研究非编码RNA与肿瘤发生的关系:l 肿瘤细胞或组织中非编码RNA的差异表达。l 肿瘤细胞中异常可变剪接体。l 肿瘤干细胞中非编码RNA基因的表达谱。生命现象和人类重大疾病中的RNA调控网络u 大规模地发现和鉴别新的人类非编码RNA及其相关的RNA结合蛋
10、白,u 解析一批非编码RNA的生物学功能及其与蛋白质的相互作用,u 阐明人类细胞分化和发育过程中RNA调控基础及作用机制,u 揭示非编码RNA与人类重大疾病的关系。RNA组学平台2)技术路线:本项目将综合运用分子生物学,结构生物学及生物信息学等手段,并将建立和发展几种新的RNA组学的方法及RNA功能研究体系来研究和发现新的非编码RNA基因RNA加工和调控机制。(1)计算机技术:建立各种适合于人类基因组分析的计算机RNA组学等平台,对人类基因组数据库进行大规模筛选,系统识别人类基因组中非编码RNA基因和顺式RNA元件等。(2)实验技术:主要包括(I)采用人细胞核内外snmRNA的实验RNA组学和
11、不同大小的非编码RNA的cDNA文库以及正常和病变组织或细胞专一性克隆等策略分别构建各种小分子非编码RNA 的cDNA文库。对文库进行大规模筛选和序列测定及分析来发现新的snmRNA。(II)以胚胎干细胞和肿瘤细胞株为模式,建立细胞分化和肿瘤发生过程中的miRNA的cDNA文库,通过比较搜寻胚胎特异的和与定向分化有关的miRNA以及与肿瘤细胞有关的特异miRNA。从胶质瘤临床标本中分离和纯化胶质瘤干细胞。分离方法采用干细胞特异性的CD133标记和流式细胞计单细胞分离法(FACS)。(III)克隆并表达Dicer全酶以及各结构域,建立体外分析体系。利用凝胶阻滞和酵母三杂交系统鉴定RNA与Dice
12、r和各结构域的结合能力和RNA内切酶活力;利用质谱鉴定Dicer的四级结构,如果为多聚体,将用酵母双杂交和化学交联方法鉴定复合物的组成方式。(VI)获取Dicer或者它的结构域的晶体,以及Dicer及其对应的RNA复合物的晶体,解出高级结构;或者利用NMR解析各结构域的结构。(V) 利用定点诱变技术获得突变的Dicer或其结构域,并利用体外分析系统分析变种功能受损情况,利用RNA 脚印实验分析Dicer及变种与RNA结合情况,结合结构数据,建立Dicer识别和加工miRNA 的模型。(VI) 利用酵母双杂交,酵母三杂交,亲和层析技术鉴定参与Dicer加工miRNA过程的可能的其它因子。(VII
13、)采用细胞水平研究策略和基因敲除老鼠模型高通亮筛选人细胞内的调控剪接的RNA外顺式作用元件ESE,以及老鼠SR剪接蛋白特异性ESE。(VIII)采用同源重组的方法逐一敲除啤酒酵母基因组中所有的内含子,检测内含子对酵母生长的必须性。对哺乳动物几个重要基因内较长的内含子进行逐级缺失突变,研究这些内含子对细胞和动物生长的影响及其包含的剪接调控元件。(IX)采用RNAi技术逐一地失活RNA结合蛋白,通过基因组水平的RNA干涉来确定大批的RNA结合蛋白在哺乳动物可变剪接调控中的作用。3)取得重大突破的可行性分析性在人类基因组草图完成后,人类基因组的DNA全序列及注释为全面系统地开展人类RNA组的研究和R
14、NA功能元件的进一步识别及其与蛋白质的相互作用奠定了良好基础;在高等复杂生物尤其是哺乳动物中,RNA的结构与功能的巨大的多样化和复杂性又为非编码RNA研究提供了广阔的空间。近年来,各种不同类型的非编码RNA尤其是小分子非编码RNA在基因表达调控中的意义和与人类重大疾病的密切关系更使RNA研究领域的每一步进展都令人瞩目。目前,在人类非编码RNA的种类及其生物学功能、RNA介导的基因时空表达和转录后加工以及RNA与细胞分化和疾病发生等方面都存在许多重大的问题有待解决,在这些前沿领域存在大量的取得重大突破的机会。此外,RNA研究还常常会取得令人意外的重要发现。参与本项目的研究团队分别来自中科院研究所
15、和教育部重点高校,拥有国家分子生物学重点实验室和生化与分子生物学国家重点学科作为依托单位,也是国内RNA研究的主要基地。主要学术带头人均为教育部“长江学者奖励计划”特聘教授和中科院著名RNA专家,具有良好的研究基础和创新性的研究思路和计划。特别是,美国加州大学圣地亚哥分校教授,武汉大学大学讲座教授付向东博士是“可变剪接”方向和“后基因组学”方面著名的生物学家,他的直接加入不但为本项目带进了该领域国际一流的学术思想,也为我们引进一些重要的实验技术资源。参与本项目的研究团队都曾经获得和/或正在执行国家自然科学基金的有关RNA的重点研究项目,也曾优秀地完成了中科院和教育部的有关RNA的重点研究项目,
16、所取得的成果为本项目奠定了良好的基础,多年的积累正在酝酿重要的突破。2.创新点与特色(1)理论方面本项目提出了在人类等高等真核生物中存在一个隐蔽的“调控RNA世界”的新观点,即由数目巨大的非编码RNA组成了细胞中一个尚未被人们所完全发现的RNA调控网络。这一RNA网络在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平等多个层次调控细胞中遗传信息的表达,在基因的转录和转录后加工、细胞分化和个体发育、遗传和表观遗传等几乎所有的重要生命活动中发挥作用。RNA调控的紊乱,将导致细胞生长和分化异常,从而进一步导致疾病发生。根据这一观点,我们预计人类非编码RNA基因的数目将远远超过目前的估计数目,并占有人类基因组相当大
17、的一部分DNA序列。因此需要开展大规模的RNA组学研究。对人类非编码RNA的研究,将从不同于蛋白质编码基因的角度来注释和阐明人类基因组的结构与功能,并为肿瘤等重大疾病的防治提供新的思路和方法。(2)研究方法和技术A过去采用计算机RNA组学研究的模式生物主要是一些简单生物如酿酒酵母、古细菌的基因组以及最近几年对植物基因组的研究。迄今为止,对庞大复杂的人类基因组中的snmRNA基因尚未有系统的研究。本项目采用计算机RNA组学和实验RNA组学相结合的方法,建立起高通量筛选和系统鉴别人类 snmRNA的技术平台,将有效地发现新的非编码RNA。B本研究拟建立高质量的细胞核非编码RNA文库、大量的排除细胞
18、质中高丰度的组成性RNA及其碎片的干扰和采用对小分子RNA 3末端高效加尾等方法,改进现有实验RNA组学的一些关键技术,将更有效地发现人细胞核内特有的和低丰度的snmRNA。本项将采用多种策略如不同大小的非编码RNA的cDNA文库和组织或细胞专一性克隆等方法,并通过基因芯片、建库消减测序结合生物信息学方法在多种人正常和病变组织或细胞中筛选差异表达的非编码RNA。C细胞内的RNA结合蛋白有上千种,目前只有很少几类剪接蛋白被鉴定出来。我们拟并发展出一种新的方法即多元化RTPCR方法来检测在不同细胞类型多种可变剪接所产生的不同成熟mRNA的表达情况。然后,通过RNAi逐一失活大量不同的RNA结合蛋白
19、(1000种左右),用以上的新方法读取不同RNA结合蛋白对多种可变剪接过程的影响。这是目前我们所知的第一次尝试高通量鉴定人细胞内参与可变剪接调控的RNA结合蛋白。(3)实验材料和研究体系A本项目拟使用自己特有的,从SR剪接蛋白的条件型基因敲除老鼠模型培养出来的细胞系来筛选只响应两种SR蛋白(SC35或ASF/SF2)的ESEs,进行体内研究。同时我们将发展一种采用细胞流式仪和高通量RTPCR相结合的新方法来筛选在人类Hela细胞内可以增强报告基因里内含子剪接的外显子增强子,然后用计算机软件分析这些体内筛选的ESEs的序列。与以前通过计算机方法和体外筛选方法所得到的结果进行对比,将提供更可靠的序
20、列来数搜和注解人类基因组的ESEs。B以肿瘤细胞系、临床标本以及最新发现的胶质瘤干细胞为实验材料,既充分利用了各细胞系遗传背景、重要基因表达状况及生物学行为特征较为确定的优点,亦充分利用了国内丰富的肿瘤临床标本资源。同时对细胞系和肿瘤干细胞以及癌前病变和癌组织进行研究,对于阐明正常细胞经过癌前病变最终转变成癌细胞以及干细胞转变为胶质瘤或其它恶性实体瘤的分子机制极其重要。国内外尚无研究肿瘤干细胞及癌前病变细胞非编码RNA表达水平及mRNA异常可变剪接的报道。3.课题设置1)课题设置:本项目共设5个课题组,分别为:(1)snmRNA基因的系统识别与鉴定;(2)miRNA在细胞分化和心血管病中的作用
21、; (3)小分子非编码RNA与蛋白质相互作用的分子基础;(4)mRNA前体可变剪接的调控;(5)RNA与肿瘤发生。课题的设置主要考虑当前本领域的研究重点和发展趋势,5个课题分别从不同的角度来研究人类非编码RNA和RNA元件及其介导的基因表达的调控机制及其与重大疾病的关系,代表了当前RNA科学领域中5个重要的发展前沿。在全国范围内,选择了中科院和重点高校中长期从事RNA研究的、具有良好国际合作基础和已作出重要成果的研究团队参与。特别重视源头创新的基础和应用研究,直接的RNA技术的应用,如RNA干涉技术在基因功能和医学及农业中的应用等,并未列为本项目的主要课题,而是作为课题中使用的一种技术或方法。
22、课题一:snmRNA基因的系统识别与鉴定1)人类snmRNA基因的计算机系统识别与鉴定根据哺乳动物许多snmRNA基因的特性,改进原有算法和分析步骤,建立起适合于人类snmRNA基因分析的计算机RNA组学平台,对人类基因组数据库进行大规模筛选,系统地识别和鉴定人类基因组中的snmRNA。新的snmRNA的实验鉴定将通过细胞核内小分子文库筛选等高通量方法进行。开展人与其它真核模式生物的比较RNA组学研究,分析snmRNA基因的结构、功能及进化。在此基础上,对snmRNA的宿主基因进行系统地分析,如宿主基因的功能类型、专一性表达和可变剪接状况,探讨snmRNA的表达和功能与宿主基因特别是那些与细胞
23、分化和疾病发生相关的宿主基因的相关性。此外,我们将研究snmRNA作为一种内含子元件参与宿主基因的选择性表达以及对mRNA可变剪接的影响和调控作用(该部分将与张翼、付向东教授合作)。2) 人细胞核内snmRNA的实验RNA组学研究以人血液淋巴细胞为材料,分离制备高纯度细胞核,建立细胞核内小分子RNA 的cDNA文库,并对文库进行大规模筛选和DNA序列测定及分析。我们将采用对小分子RNA 3末端高效加尾、芯片筛选排除高丰度已知RNA的干扰等方法来改进现有实验RNA组学的一些关键技术。预期可发现一批人细胞核内特有的低丰度的snmRNA。并对新的snmRNA表达和细胞定位、结构与功能作进一步研究。3
24、)人正常和病变组织或细胞专一性表达的snmRNA的研究以人脑、肝、血液淋巴细胞等多种正常组织以及两种肿瘤细胞株为材料,建立和发展新的实验RNA组学方法,包括采用不同大小的非编码RNA的cDNA文库和组织或细胞专一性克隆等策略分别构建各种组织或细胞专一性的小分子非编码RNA 的cDNA文库。对文库进行大规模筛选和序列测定分析,预期可发现一批与细胞分化和疾病相关的snmRNA。开展对差异表达的非编码RNA功能的进一步研究(该部分将与庄诗美等教授合作)。预期目标:建立起适合于人类基因组和哺乳动物等高等真核模式生物分析的计算机RNA组学、比较基因组学分析平台和高通量的实验RNA组学研究体系,完成大规模
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- 关 键 词:
- 人类 编码 RNA 及其 基因 表达 调控