《医学生物化学》课件第20章-分子生物学技术基本原理.ppt
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1、第第 一一 节节 聚聚 合合 酶酶 链链 反反 应应Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain ReactionCycle 25 Primer 15 Primer 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 一、基本工作原理一、基本工作原理Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后,模板次循环后,模板DNA的含的含量可以扩大量可以扩大100万倍以上。万倍以上。n模板模板DNAn 特异性引物特异性引物n耐热耐热DNA聚合酶聚合酶n dNTPsn Mg2
2、+一、一、PCRPCR体系基本组成成分体系基本组成成分二、二、PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C(一)目的基因的克隆(一)目的基因的克隆(二)基因的体外突变(二)基因的体外突变(三)(三)DNA和和RNA的微量分析的微量分析(四)(四)DNA序列测定序列测定(五)基因突变分析(五)基因突变分析三、三、PCR的主要用途的主要用途四、几种重要的四、几种重要的PCR衍生技术衍生技术(一)反转录(一)反转录PCR技术技术(二)原位(二)原位PCR技术技术(三)实时(三)实时PCR技术技术(四)(四)MS-PCR技术技术实时实时PCRPCR技术原理技术原理第
3、第 二二 节节印迹技术印迹技术 (一)印迹技术(一)印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到转移到NC等各种膜上,使之成为固相化分子。等各种膜上,使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹,因这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹,因此称之为此称之为“blotting”,译为印迹技术。,译为印迹技术。一、分子杂交和印迹技术的原理一、分子杂交和印迹技术的原理用放射性核素、生物素或荧光染料标记其用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针探针”,探针可以与
4、固定在,探针可以与固定在NC膜上的核苷膜上的核苷酸结合,判断是否有同源的核酸分子存在。酸结合,判断是否有同源的核酸分子存在。(二)探针技术(二)探针技术一、分子杂交和印迹技术的原理一、分子杂交和印迹技术的原理二、印迹技术的类别及应用二、印迹技术的类别及应用(一)(一)DNA印迹印迹(Southern Blotting)(二)(二)RNA印迹印迹(Northern Blotting)(三)蛋白质的印迹(三)蛋白质的印迹(Western Blotting)用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。、重组质粒和噬菌体的分析。用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。用于蛋白质定性定量及
5、相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。n其他:其他:斑点印迹斑点印迹(dot blotting)原位杂交原位杂交(in situ hybridization)DNA点阵点阵(DNA array)DNA芯片技术芯片技术(DNA chip)三三种种印印迹迹技技术术的的比比较较分子杂交实验分子杂交实验第第 三三 节节生物芯片技术生物芯片技术是指将许多特定的是指将许多特定的DNADNA片段有规律地紧密排列片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上,然后与待测的荧光固定于单位面积的支持物上,然后与待测的荧光标记样品进行杂交,杂交后用荧光检测系统等对标记样品进行杂交,杂交后用荧光检测系统等对芯
6、片进行扫描,通过计算机系统对每一位点的荧芯片进行扫描,通过计算机系统对每一位点的荧光信号进行检测、比较和分析,从而迅速得出定光信号进行检测、比较和分析,从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列微阵列(DNA microarray)。一、基因芯片一、基因芯片n基因芯片基因芯片(gene chip)(gene chip)n基因芯片工作流程示意图基因芯片工作流程示意图是是将将高高度度密密集集排排列列的的蛋蛋白白分分子子作作为为探探针针点点阵阵固固定定在在固固相相支支持持物物上上,当当与与待待测测蛋蛋白白样样品品反反应应时时,可可捕捕获获样样品品中中的的靶
7、靶蛋蛋白白,再再经经检检测测系系统统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片蛋白质分子间的亲和反应蛋白质分子间的亲和反应n蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip)(protein chip)n蛋白质芯片作用原理蛋白质芯片作用原理第第 四四 节节生物大分子相互作用研究技术生物大分子相互作用研究技术一、蛋白质相互作用研究技术一、蛋白质相互作用研究技术酵母双杂交酵母双杂交各种亲和分析(标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等)各种亲和分析(标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等)荧光共振能量转换效应分析荧光共振能量转换效应分析n常用蛋白质相互作用的研究技
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