《食品卫生检测技术》课件第08章.ppt
《《食品卫生检测技术》课件第08章.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《《食品卫生检测技术》课件第08章.ppt(95页珍藏版)》请在文库网上搜索。
1、食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术 第八章第八章食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术第一节第一节 食品中肠道致病菌的检测食品中肠道致病菌的检测第二节第二节 食品中致病性球菌的检测食品中致病性球菌的检测第三节第三节 其他致病菌检验其他致病菌检验食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术 第一节第一节 食品中肠道致病菌的检测食品中肠道致病菌的检测 一、沙门氏菌的检验一、沙门氏菌的检验 (一)概述(一)概述 沙门氏菌(Salmonella)广泛分布于自然界,是对人类和动物的重要致病菌。因为多种动物肠道带菌率很高,可由不同方式污染食品,引起食物中毒暴发。在各类细菌性食物中毒中,沙门
2、氏菌食物中毒屡占首位。沙门氏菌为需氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌,有动力,在周生鞭毛(但有无动力的变种),能在普通培养基上生长良好,最适生长温度为37,最适pH值为7.27.6,在固体培养基上37,24h菌落可呈中等大小,光滑,圆形,湿润,隆起,在液体培养基内生长均匀混浊。食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术 在检品中,沙门氏菌含量较少或食品加工过程中使其受到损伤而处于濒死的状态时,为了能够分离出沙门氏菌,需要选用增菌培养的办法,如冻冷食品和加工食品必须经过前增菌,使检品中的沙门氏菌恢复其活力,对未经加工的新鲜食品,不必进行前增菌,可用选择性增菌培养,使沙门氏菌得以增殖,而使大多数的其他细菌
3、受到抑制,再进行分离,可以提高沙门氏菌的检出率。沙门氏菌的型别种类繁多,现已达2000余种,根据该菌的特征,其检验及鉴定方法需经较为繁杂的手段才能确切的识别,一般分为前增菌、选择性增菌、分离培养、生化鉴定、血清学分型五个步骤。食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术 (二)检测方法(二)检测方法 1 1前增菌和增菌前增菌和增菌 冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。以无菌操作取检样25g(mL),加在装有225mL缓冲蛋白胨水 的 500mL广 口 瓶 内。固 体 食 品 可 先 应 用 均 质 器 以8000r/minl0000r/min打碎lmin,或用乳钵加灭菌砂磨碎;粉状食
4、品用灭菌匙或玻棒研磨使乳化,于36l培养4h(干蛋品培养l824h),移取l0mL,转种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液(MM)或四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液内,于42培养l824h。同时,另取l0mL,转种于l00mL亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液内,于36l培养l8h24h。食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术 鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。各取25 g(25mL)加入灭菌生理盐水25mL,按前法做成检样匀液;取25mL,接种于100mL氯化镁孔雀绿(MM)增菌液或四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液内,于42培养24h;另取25mL接种于100mL亚硒酸盐胱氨酸(S
5、C)增菌液内,于36l培养1824h。2 2分离分离 取增菌液1环,划线接种于一个亚硫酸铋(BS)琼脂平板和一个DHL琼脂平板(或HE琼脂平板、WS或SS琼脂平板)。两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。于36l分别培养1824h(DHL、HE、WS、SS)或4048h(BS),观察各个平板上生长的菌落,沙门氏菌、和沙门氏菌在各个平板上的菌落特征见表8-l。食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术 3 3生化试验生化试验 (1)自选择性琼脂平板上直接挑取数个可疑菌落,分别接种三糖铁琼脂。一般应多挑几个菌落,以防遗漏。在三糖铁琼脂内,肠杆菌科常见
6、属种的反应结果见表8-2。表8-2说明在三糖铁琼脂内只有斜面产酸并同时硫化氢(HS)阴性的菌株可以排除,其他的反应结果均有沙门氏菌的可能,同时也均有不是沙门氏菌的可能。因此都需要做几项最低限度的生化试验。必要时做图片染色镜检应为革兰氏阴性短杆菌,做氧化酶试验应为阴性。食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术 (2)在接种三糖铁琼脂的同时,再接种蛋白胰水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各一管,于36l培养l824h,必要时可延长至48h,按表8-3判定结果。按反应序号分类,沙门氏菌属的结果应属于Al、A2和B1,其他5种反
7、应结果均可以排除。食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术 反应序号A1 典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、氰化钾和赖氨酸三项中有一项异常,按表8-4可判定为沙门氏菌。如有两项异常,则按A3判定为弗劳地氏柠檬酸杆菌。反应序号A2 补做甘露醇和山梨醇试验,按表8-5判定结果。食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术 反应序号Bl 补做ONPG。若ONPG(),为大肠埃希氏菌,若ONPG(),为沙门氏菌。同时,沙门氏菌应为赖氨酸(),但甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸()。必要时可按表8-6进行沙门氏菌生化群的鉴别。食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术 4 4血清学分型鉴定血清学分型鉴定
8、 一般采用1.5%琼脂斜面培养物做玻片凝集试验。O血清不凝集时,将菌株接种在琼脂量较高的(如2.5%3%)培养基上再检查;如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时,可挑取菌苔于lmL生理盐水中做成浓菌液,于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时,将菌株接种在0.7%0.8%半固体琼脂平板的中央,俟菌落蔓延生长时,在其边缘部分取菌检查;或将菌株通过装有03%0.4%半固体琼脂的小玻管l次2次,自远端取菌培养后再检查。食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术 (1)O抗原的鉴定 首先用AF多价血清做玻片凝集试验,同时用生理盐水做对照,在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株,不能分型。凡AF多价
9、血清呈现凝集者,可依次用因子血清做凝集试验。根据试验结果,判定群。如不被AF多价血清凝集者,可用57种或163种沙门氏菌因子血清中的7种多价血清检查,如有其中一种血清凝集,则用这种血清包括的O群血清逐一检查,以确定O群。如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时,可将菌苔用生理盐水作成浓菌液煮沸后再检查。食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术 (2)H抗原的鉴定 根据所确定的O群,依次用H因子血清检查1相和2相的H抗原,对不常见的菌型,可先用多价H血清检查,如其中某种多价血清凝集时,则再用此血清所包括的H因子血清逐一检查,以确定第1相和第2相的H抗原,如无单因子血清时,要用两个H复合因
10、子血清核对其检查地结果。如仅检出第1相或第2相时,可在琼脂斜面上移种12代后再检查,若仍为一相,要用位相变异的方法检查其另一相H抗原。食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术 常用的位相变异试验方法如下:小玻管法:将半固体管(每管12mL)在酒精灯上溶化并冷却至50,取已知相的H因子血清0.05 0.1 mL,加入已溶化的半固体内,混匀后,用毛细管吸取分装于供位相变异试验的小玻璃管内,俟凝固后,用接种针挑取待检菌,接种于一端。将小玻管平放在平皿内,并在其旁放一团湿棉花,以防琼脂中水分蒸发而干缩,每天检查结果,待另一相细菌解离后,可以从另一端挑取细菌进行检查。培养基内血清的浓度应有适当的比例
11、,过高时细菌不能生长,过低时同一相细菌的动力不能抑制。一般按血清1:2001:800的量加入。于37培养后再做凝集试验。食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术 小倒管法:将两端开口的小玻璃管(下端开口要留一个缺口。不要平齐)放在半固体管内,小玻管的上端应高出于培养基的表面,灭菌后备用。临用时将琼脂在酒精灯上加热溶化,冷至50,挑取已知H因子血清l环,加人小套管中的半固体内,略加搅拌,使其混匀,俟凝固后,将待检菌株接种于小套管中的半固体表层内,每天检查结果,待另一相细菌解离后,可从套管外的半固体表面取菌检查,或转种l%软琼脂斜面,于37培养后再做凝集试验。食品中致病菌的检测技术食品中致病菌
12、的检测技术 简易平板法:将0.7%0.8%半固体琼脂平板烘干表面水分,挑取因子血清1环,滴在半固体平板表面,放置片刻,待血清吸收到琼脂内,在血清部位的中央点种待检菌株,培养后,在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查。(3)Vi抗原的鉴定 用Vi因子血清检查。已知具有Vi抗原的菌型有:伤寒沙门氏菌,丙型副伤寒沙门氏菌,都柏林沙门氏菌。5 5菌型的判定和结果报告菌型的判定和结果报告 综合以上生化试验和血清学分型鉴定的结果,按照沙门氏菌属抗原表判定菌型,并报告结果。食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术 二、志贺氏菌的检验二、志贺氏菌的检验 (一)概述(一)概述 志贺氏菌(Shigella)是人类重
13、要的肠道致病菌之一,食物源性的痢疾爆发(即志贺氏菌食物中毒),主要是食用了被污染该菌的食品和水所致。志贺氏菌为需氧性革兰氏阴性无芽胞杆菌,在普通培养基上易于生长,最适pH为6.47.8,最适温度为37,于1040均能繁殖,在选择性或鉴别培养基上为无色,半透明,微凸起,光滑,湿润,边缘整齐,直径约2mm大小的菌落,但宋内氏志贺氏菌常出现R形菌落。在液体培养基中呈均匀混浊,无鞭毛,无动力。食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术 志贺氏菌因在食品中的存活期较短,当样品采集后应尽快进行检验,如不能立即检查时,可将标本放入冰箱保存。对该菌的检验至今还没有很好的增菌方法,一般采用GN增菌液,缩短增菌
14、时间,68h增菌液内细菌轻微生长,即可接种鉴别平板,以免时间较长,其他肠道非致病细菌生长过多而影响志贺氏菌的分离。用于分离鉴别的培养基,一般不少于两个,采用中等选择性的HE或SS琼脂平板和弱选择性的麦康凯或EMB琼脂平板,以利于志贺氏菌的阳性检出率。食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术 志贺氏菌属在三糖铁琼脂内的反应结果为底层产酸、不产气(福氏志贺菌6型可微产气),斜面产碱,不产生硫化氢,无动力,在半固体管内沿穿刺线生长。不发酵水杨苷和侧金盏花醇,不分解尿素,在西蒙氏柠檬酸盐培养基上不生长,V-P为阴性,不发酵乳糖(宋内氏志贺氏菌可迟缓发酵),不能使赖氨酸脱羧,宋内氏菌和鲍氏B型可使鸟
15、氨酸脱梭,其他均为阴性。检验方法一般分为增菌、分离、生化试验及血清学鉴定。食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术 (二)检测方法(二)检测方法 1 1增菌增菌 以无菌操作取检样25g(mL),加入装有225mLGN增菌液的500 mL广口瓶内,固体食品用均质器以8000r/minl0000r/min打碎lmin,或用乳钵加灭菌砂磨碎;粉状食品用灭菌金属匙或玻璃棒研磨使其乳化。于36培养68h。培养时间视细菌生长情况而定,当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。2 2分离和初步生化试验分离和初步生化试验 (1)取增菌液1环,划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板一个;另取l环划线接种于麦康凯琼脂
16、平板或伊红美蓝琼脂平板一个,于36培养1824h,志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术 (2)挑取平板上的可疑菌落,接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各一管。一般应多挑几个菌落,以防遗漏,经36培养1824h,分别观察结果。(3)下述培养物可以弃去:在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物;在18h24h内发酵乳糖、蔗糖的培养物;不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物;产气的培养物;有动力的培养物;产生硫化氢的培养物。食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术 (4)凡是乳糖、蔗糖不发酵,葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少量气体),
17、无动力的菌株,可做血清学分型和进一步的生化试验。3 3血清学分型和进一步的生化试验血清学分型和进一步的生化试验 (1)血清学分型 挑取三糖铁琼脂上的培养物,做玻片凝集试验。先用四种志贺氏菌多价血清检查,如果由于K抗原的存在而不出现凝集,应将菌液煮沸后再检查;如果呈现凝集,则用Al、A2、B群多价和D群血清分别试验。如系B群福氏志贺氏菌,则用群和型因子血清分别检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表8-7。可先用群因子血清检查,再根据群因子血清出现凝集的结果,依次选用型因子血清检查。食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术 4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株,可用鲍氏多价1、2、3分别检查
18、,并进一步用115各型因子血清检查。如果鲍氏多价血清不凝集,可用痢疾志贺氏菌312型多价血清及各型因子血清检查。食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术 (2)进一步的生化试验 在做血清学分型的同时,应做进一步的生化试验,即:葡萄糖铵,西蒙氏柠檬酸盐,赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶,pH7.2尿素,氰化钾(KCN)生长,以及水杨苷和七叶甘的分解。除宋内氏菌和鲍氏13型为鸟氨酸阳性外,志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。必要时还应做革兰氏染色检查和氧化酶试验,应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。生化反应不符合的菌株,即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集,仍不得判定为志贺氏菌属的培养物。食品中致病菌的检测技术食
19、品中致病菌的检测技术 已判定为志贺氏菌属的培养物,应进一步做5%乳糖发酵,甘露醇、棉籽糖和甘油的发酵和靛基质试验。志贺氏菌属四个生化群的培养物,应符合该群的生化特性。但福氏6型的生化特性与A群或C群相似,见表8-8。(三)结果报告(三)结果报告 综合以上生化和血清学的试验结果,判定菌型并作出报告。食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术 三、致泻大肠埃希氏菌的检验三、致泻大肠埃希氏菌的检验 (一)概述(一)概述 大肠埃希氏菌作为正常菌群而存在于人和动物肠道中,并广泛存在于自然界。大肠埃希氏菌的某些菌株对人有致病性。人和动物的带菌是传播本菌引起食物中毒的重要原因。致泻大肠埃希氏菌(Esche
20、richia coli),简称致病性大肠菌。根据其致病机制可分为4个类型。肠道致病性大肠菌(Enteropathogenic E.coli,EPEC),肠道侵袭性大肠菌(Ente roinvasive Ecoli,EIEC),产肠毒素大肠菌(Enterotoxigenic Ecoli,ETEC),肠道出血性大肠菌(Enterohemorrhagic E.coli,EHEC)。EPEC主要引起新生儿的腹泻。EPEC、ETEC引起腹泻腹痛型胃肠炎。EIEC引起的胃肠炎酷似痢疾。EHEC引起出血性大肠炎。食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术 (二)检测方法(二)检测方法 1 1增菌增菌 样品
21、采集后应尽快检验。除了易腐食品在检验之前预冷藏外,一般不冷藏。以无菌操作取检样25g(mL),加在225mL营养肉汤中,以均质器打碎lmin或用乳钵加灭菌砂磨碎。取出适量,接种乳糖胆盐培养基,以测定大肠菌群MPN值,其余的移人500mL广口瓶内,于36l培养6h。挑取1环,接种于1管30mL肠道菌增菌肉汤内,于42培养l8h。食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术 2 2分离分离 将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平板;污染严重的检样,可将检样匀液直接划线接种麦康凯或伊红美蓝平板,于36l培养1824h,观察菌落。不但要注意乳糖发酵的菌落,同时也要注意
22、乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。3 3生化试验生化试验 (1)自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁琼脂(TSI)或克氏双糖铁琼脂(KI)。同时将这些培养物分别接种蛋白胨水、半固体琼脂、pH7.2尿素琼脂、KCN肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基。以上培养物均在36培养过夜。食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术 (2)TSI斜面产酸或不产酸,底层产酸,H2S阴性,KCN阴性和尿素阴性的培养物为大肠埃希氏菌。TSI底层不产酸,或H2S、KCN、尿素等试验中有任一项为阳性培养物,均非大肠埃希氏菌。必要时做氧化酶试验和革兰氏染色。4 4血清学试验血清学试验 (1)假定试验 挑取经生化试验证实为大肠
23、埃希氏菌琼脂培养物,用致病性大肠埃希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多价O血清和出血性大肠埃希氏菌O157血清做玻片凝集试验。当与某一种多价O血清凝集时,再与该多价血清所包含的单价O血清做试验。致泻大肠埃希氏菌所包括的O抗原群见表8-9。如与某一个单价O血清呈现强凝集反应,即为假定试验阳性。食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术 (2)证实试验 制备O抗原悬液,稀释至与Mac Farland3号比浊管相当的浓度。原效价为1:1601:320的O血清,用0.5%盐水稀释至1:40。稀释血清与抗原悬液在l0mm75mm试管内等量混合,做单管凝集试验。混匀后放于50水浴锅内,经l
24、6h后观察结果。如出现凝集,可证实为该O抗原。食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术 5 5肠毒素试验肠毒素试验 产毒培养:将试验菌株和阳性及阴性对照菌株分别接种于0.6mLCAYE培养基内,37C振荡培养过夜。加入20000IU/mL的多粘菌素B0.05mL,于37l h,以4000r/min 离心l5min,分离上清液,加入0.1硫柳汞0.05mL,于4保存待用。(1)酶联免疫吸附试验检测不耐热肠毒素LT(双抗体夹心法):包被 先在产肠毒素大肠埃希氏菌LT和ST酶标诊断试剂盒中取出包被用LT抗体管,加入包被液0.5mL,混匀后全部吸出于3.6mL包被液中混匀,以每孔100L量加入到4
25、0孔聚苯乙烯硬反应板中,第一孔留空作对照,于4冰箱湿盒中过夜。食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术 洗板 将板中溶液甩去,用洗涤液I洗三次,甩尽液体,翻转反应板,在吸水纸上拍打,去尽孔中残留液体。封闭 每孔加100L封闭液,于37水浴中l h。洗板 用洗涤液II洗三次,操作同上。加样本 每孔分别加各种试验菌株产毒培养液100L,37水浴中l h。洗板 用洗涤液II洗三次,操作同上。加酶标抗体 先在酶标LT抗体管中加0.5mL稀释液,混匀后全部吸出于3.6mL稀释液中混匀,每孔加100L,37水浴中1 h。食品中致病菌的检测技术食品中致病菌的检测技术 洗板 用洗涤液II洗三次,操作同上。
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 食品卫生检测技术 食品卫生 检测 技术 课件 08